Análisis de la actividad neuronal en neuronas primarias de ganglios espirales murinos mediante matrices de electrodos múltiples

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

>1. Registros electrofisiológicos para investigar la actividad espontánea y dependiente de la estimulación electroda

1. Lavar el cultivo de la matriz de electrodos múltiples (MEA) con solución extracelular, a temperatura ambiente (RT).
2. Seque los contactos con un pañuelo de papel y monte el MEA en la configuración MEA.
   nota: Para mantener el cultivo húmedo durante el montaje, agregue una pequeña gota de solución extracelular al cultivo.
3. Agregue 300 μl de solución extracelular y espere 10 minutos antes de grabar, para permitir que el sistema se estabilice.
4. Registre la actividad espontánea durante 2 minutos de todos los electrodos pulsando el botón de grabación/adquisición del software e identifique los electrodos de registro.
5. Estimulación con electrodos MEA: Seleccione la amplitud/duración/forma del estímulo en el software adecuado y aplíquelo a varios electrodos consecutivamente. Seleccione los electrodos en función de los que muestren actividad espontánea (como en el paso 1.4). Registre de todos los electrodos restantes.
6. Para excluir el artefacto de estimulación, estimule desde el mismo electrodo 10 veces. Si el cultivo responde al menos 8 de cada 10 veces, se puede suponer que es una respuesta positiva a la estimulación inducida por electrodos.
7. Para identificar el ruido de fondo, aplique tetrodotoxina (TTX) al cultivo a una concentración de 1 μM, para bloquear los canales de sodio dependientes de voltaje y registre durante 2 min. Utilícelo para realizar la detección de picos (2.1 y 2.2).

>2. Análisis de datos

1. Utilizando el software adecuado, detecte la actividad espontánea de cada electrodo empleando un detector basado en desviaciones estándar y un discriminador posterior. La actividad aparece como transitorios de voltaje rápido (<5 mseg).
2. Elija un umbral que no provoque ninguna actividad al analizar las muestras tratadas con TTX. Adapte el valor de umbral de cada experimento para discriminar entre detecciones de falsos positivos y falsos negativos.
3. Utilizando el software adecuado, observe la actividad neuronal detectada de cada electrodo como un gráfico ráster de acuerdo con los procedimientos estándar (ver Figura 1A-C).
4. Determine y muestre la actividad total de la red sumando todos los eventos detectados dentro de una ventana deslizante de 10 mseg, desplazada en pasos de 1 mseg.
5. Detecte la actividad inducida por la estimulación mediante la visualización de los datos brutos utilizando el software de análisis adecuado. Identifique los picos individuales fuera de línea manualmente. Los picos individuales aparecen como transitorios de voltaje rápido, que ocurren después del artefacto de estimulación (punta de flecha en la Figura 1E). Un ejemplo se muestra en la Figura 1E.
6. Dependiendo del experimento, analice el número de electrodos que responden, el umbral necesario para lograr una respuesta, el número de potencial de acción por electrodos y otros parámetros de interés.

Figura 1. Registros de datos en MEA. (A) Rastros de grabaciones originales de seis de los 63 electrodos que muestran actividad espontánea. (B) Diagrama ráster de los seis electrodos de la Figura 1A después de la detección de picos. Cada barra representa un potencial de acción. (C) Diagrama ráster que incluye todos los electrodos (como en A y B) La actividad se registra de 63 electrodos (canales número 0-63) durante 2 min. (D) Se utilizó un estímulo bifásico con una duración total de 80 μsec y una amplitud de 80 μA para la estimulación del cultivo de un electrodo (E58 en la Figura 2F). (E) Ejemplo representativo de trazas de datos brutos obtenidos después de la estimulación del electrodo 58 que muestran potenciales de acción (trazas rojas) o sin respuestas (trazas azules) después de la estimulación (punta de flecha negra). (F) Cultivo de ganglios espirales en MEA inmunoteñido para el marcador neuronal TUJ (verde) al final del experimento para visualizar la cobertura neuronal del área del electrodo. El electrodo 58 utilizado para la estimulación se indica en verde, los electrodos que responden se indican en rojo. Barra de escala = 50 μm.