Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
NOTA: Cada participante involucrado en el procedimiento debe estar debidamente capacitado en procedimientos quirúrgicos básicos y debe tener una licencia válida para realizar experimentos con animales.
1. Anestesia y premedicación
- Anestesiar una rata con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (una dosis inicial de 60 mg·kg-1 para ratas Wistar macho de 6 meses de edad con un peso de 400 a 550 g)
nota: Este protocolo no se limita a la cepa, el sexo o la edad indicados de las ratas. Además, se pueden utilizar anestesias alternativas, como la mezcla de ketamina y xilacina, alfa-clolorosa o fentanilo+midazolam+medetomidina, si son más adecuadas para diferentes objetivos de investigación o cuando así lo requiera el comité de ética.
- Después de aproximadamente 5 minutos, verifique la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo de la extremidad trasera de la rata con pinzas romas. Continúe con los siguientes pasos del protocolo solo cuando no se observe ninguna acción refleja.
- Inyectar 0,05 mL de atropina por vía subcutánea para reducir la producción de moco después de la intubación.
- Inyectar por vía subcutánea 5 mL de tampón de fosfato que contenga una solución de glucosa al 4%, NaHCO3 (1 %) y gelatina (14 %). Este tampón será absorbido por los vasos cutáneos a lo largo de un experimento y ayudará a mantener el equilibrio de líquidos.
- A lo largo de la cirugía, revisar periódicamente los reflejos del animal y suplementar la anestesia si es necesario (10 mg·kg-1· h-1 de pentobarbital sódico).
>2. Cirugía
- Prepare al animal para el tratamiento quirúrgico afeitando el pelo sobre la parte dorsal de la extremidad posterior izquierda, desde el tobillo hasta la cadera, la parte trasera, desde la cola hasta los segmentos torácicos superiores (Th), el lado izquierdo del tórax y el lado ventral de la zona del cuello por encima del esternón
- Colocación de la vía intravenosa
- Coloque a la rata boca arriba sobre una almohadilla térmica de circuito cerrado (y asegúrela con fijaciones de extremidades).
- Con una cuchilla de 21 hojas, haz un corte longitudinal a través de la piel desde el esternón hasta la barbilla.
- Sujete la piel con pinzas y sepárela del tejido subyacente.
- Usando técnicas de disección roma, exponga la vena yugular derecha. Diseccione cuidadosamente la vena de los tejidos circundantes.
- Ubique la parte de la vena sin puntos de ramificación y deslice dos ligaduras 4-0 debajo de ella.
- Haga un nudo suelto en el extremo proximal del segmento no ramificado de la vena previamente identificado y un nudo suelto en el extremo distal de este segmento de la vena. Pinzar la vena proximal al corazón y luego ligar la parte distal de la vena.
- Con unas tijeras de iris, haga una incisión entre la pinza y la ligadura distante. Sostenga un colgajo de la vena e introduzca un catéter precargado hasta el punto donde queda bloqueado por la pinza.
- Mientras sujeta la vena y el catéter con pinzas, retire la pinza y empuje el catéter varios milímetros dentro de la vena. Asegure ambos extremos del catéter a la vena y agregue un punto de fijación adicional a la piel.
>3. Introducción del tubo traqueal
- Con pinzas romas, separe las dos glándulas mandibulares que cubren los músculos esternohioideos. Separe los músculos esternohioideos en la línea media para exponer la tráquea.
- Deslice tres ligaduras 4-0 debajo de la tráquea, luego haga dos nudos por debajo del punto de inserción del tubo traqueal y un nudo por encima.
- Localice el cartílago cricoides de la laringe y haga una incisión debajo del tercer cartílago traqueal.
- Inserte un tubo traqueal por la tráquea y asegure el tubo en su lugar con ligaduras preparadas previamente, luego agregue una ligadura adicional a la piel.
- Coloque un pequeño trozo de algodón sobre los músculos separados y suture la piel sobre el área operada.
>4. Disección de los nervios de las extremidades posteriores
- Con una hoja 21, haga un corte longitudinal en la parte posterior de la extremidad trasera izquierda, desde el tendón de Aquiles hasta la cadera.
- Agarre la piel con fórceps y, mediante técnicas de disección contundentes, separe la piel de los músculos subyacentes a ambos lados de la incisión.
- Localiza la fosa poplítea en la parte posterior de la articulación de la rodilla, que está cubierta por el músculo bíceps femoral, y con unas tijeras, haz un corte entre la parte anterior y posterior de este músculo.
- Moviéndose hacia arriba, corte dos cabezas del bíceps femoral hasta la cadera para exponer el nervio ciático. Cauterice según sea necesario para prevenir el sangrado.
- Identificar las ramas sural, tibial y peronea común del nervio ciático.
- Con unas tijeras, separe la cabeza lateral de la medial del músculo gastrocnemio para exponer el nervio tibial y sus ramas.
- Con 55 pinzas, agarre el extremo distal del nervio sural, córtelo distalmente y diseccione lo más lejos posible.
- Repita el procedimiento con el nervio peroneo común.
- Con una varilla de vidrio roma, separe el nervio tibial de los tejidos circundantes, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos, y córtelo distalmente.
- Identificar los nervios gastrocnemio medial (MG) y los nervios gastrocnemio lateral y sóleo (LGS).
- Con 55 pinzas, diseccione cuidadosamente los nervios MG y LGS, desconectándolos de los tejidos circundantes pero manteniendo su conexión con los músculos respectivos.
- Coloque un trozo de algodón empapado en solución salina debajo de los nervios expuestos.
- Cierre la piel sobre el área operada.
>5. Laminectomía
- Con una cuchilla de 21, haga una incisión longitudinal desde el sacro hasta las vértebras torácicas.
- Separe la piel de los músculos subyacentes.
- Cortar el músculo longissimus a ambos lados de las apófisis espinosas torácicas y lumbares.
- Con un bisturí de borde romo, retraiga los músculos de la columna vertebral para exponer las apófisis transversas de cada vértebra.
- Con unas tijeras de punta roma, corte los tendones de los músculos conectados a las apófisis transversas a lo largo de la columna vertebral expuesta. Aplicar agentes hemostáticos si es necesario.
- Identificar la vértebra Th13 como el segmento torácico más bajo con inserción costal y, mediante el uso de rongeurs finos, extirpar las apófisis espinosas y las láminas de las vértebras Th13 a L2 para exponer los segmentos lumbares de la médula espinal. Recuerde no dañar la apófisis espinosa L3, que se utilizará como punto de fijación para la estabilización de la columna vertebral.
- Retire la apófisis espinosa Th12 y alise la superficie dorsal de la vértebra tanto como sea posible.
- Usando técnicas de disección roma, separe los músculos de la vértebra Th11 para crear puntos de inserción de soporte.
- Coloque un algodón delgado empapado en solución salina sobre los segmentos de la médula espinal expuestos.
- Mueva la rata al marco de metal hecho a medida con dos barras paralelas y dos brazos ajustables con abrazaderas para sostener y estabilizar la columna vertebral.
>6. Preparación para la grabación y estimulación
- Fijación de la columna vertebral y disposición de los nervios
- Coloque la rata en el marco hecho a medida sobre una almohadilla térmica conectada al sistema de calefacción de circuito cerrado para mantener la temperatura corporal del animal a 37 ± 1 ° C.
- Inserte electrodos de electrocardiograma (ECG) debajo de la piel y conéctelos a un amplificador para monitorear la frecuencia cardíaca.
- Usando los colgajos de piel, forme un charco profundo sobre la médula espinal expuesta.
- Usando pinzas metálicas, fije la columna vertebral colocando pinzas debajo de las apófisis transversales Th12 y en la apófisis espinosa L3.
- Asegúrese de que la columna vertebral esté asegurada y dispuesta horizontalmente, y luego aplique presión dorso-ventral a ambos lados de la columna para retraer los músculos.
- Llene la piscina con aceite mineral tibio (37 °C) y manténgala a esta temperatura.
- Pase una ligadura 4-0 a través del tendón de Aquiles, levante y estire la extremidad trasera izquierda operada para que el tobillo quede nivelado con la cadera.
- Con los colgajos de piel, haga una piscina profunda sobre los nervios tibial, MG y LGS expuestos.
- Llene la piscina con aceite mineral tibio (37 °C).
- Coloque los nervios MG y LGS en electrodos estimulantes bipolares de alambre de plata y conéctelos a un estimulador de pulso cuadrado. Use canales de estimulación separados para cada nervio.
7. Colocación de electrodos en superficie
- Coloque un electrodo de bola de plata en el lado caudal izquierdo de la médula espinal expuesta, con un electrodo de referencia insertado en los músculos de la espalda, y conecte ambos electrodos al amplificador de CC diferencial. El electrodo de bola de superficie se utilizará para registrar las descargas aferentes de los nervios.
- Usando un estimulador de corriente constante, estimule los nervios MG y LGS con pulsos cuadrados de 0,1 ms de duración, repetidos a una frecuencia de 3 Hz, y observe las descargas aferentes.
- Determine el umbral (T) para la activación del nervio, estimule cada nervio a una intensidad aproximada de 3·T y registre la amplitud de la descarga aferente para cada nervio.
- Mueva el electrodo de superficie rostral y repita el procedimiento para identificar los segmentos espinales en los que las amplitudes de las descargas son las más altas para cada nervio. Después de determinar la ubicación máxima de la volea, mueva el electrodo de superficie a una distancia segura de la médula espinal.
- Parálisis muscular y formación de un neumotórax para reducir los movimientos respiratorios
- Paralizar la rata por vía intravenosa con un bloqueador neuromuscular y conectar el tubo traqueal a un ventilador externo en línea con un capnómetro compatible con roedores (bromuro de pancuronio, a una dosis inicial de 0,4 mg·kg-1, suplementado cada 30 min en dosis de 0,2 mg·kg-1)
- Controle la concentración de CO2 al final de la espiración y manténgala en aproximadamente el 3-44% ajustando los parámetros de ventilación (frecuencia, presión de aire y volúmenes de flujo).
- Hacer una incisión longitudinal en la piel entre la 5ª y la 6ª costilla del lado de la grabación.
- Con unas tijeras de punta roma, corte los músculos suprayacentes para visualizar el espacio intercostal entre las costillas.
- Con unas tijeras pequeñas y afiladas, haga una pequeña incisión en los músculos intercostales y en la pleura, luego inserte la punta de una pinza de borde romo en la abertura, teniendo cuidado de no presionar los pulmones.
- Permita que las pinzas se expandan o inserte un pequeño tubo para mantener el neumotórax abierto durante todo el experimento.
- Después del bloqueo neuromuscular, controle la profundidad de la anestesia verificando la frecuencia del ECG y complemente el agente anestésico si la frecuencia cardíaca supera los 400 lpm. Parálisis muscular y formación de un neumotórax para reducir los movimientos respiratorios, lo que mejorará la estabilidad de la grabación.
>8. Apertura de la duramadre y la piamadre
- Con las pinzas #55, levante suavemente la duramadre y córtela caudalmente desde el segmento L5, rostralmente hasta el segmento L4.
- Con un par de pinzas ultrafinas 5SF, haga un pequeño parche en la pia que cubre la columna dorsal entre los vasos sanguíneos, exactamente al nivel de la descarga aferente máxima del nervio MG o LGS.
- Use pequeños pedazos de espuma de gel seca y empapada en solución salina para bloquear el sangrado si es necesario.
>9. Colocación de electrodos de estimulación transespinal de corriente directa (tsDCS)
- Realizar una pequeña incisión en la piel del lado ventral del abdomen de una rata a nivel rostrocaudal correspondiente a la ubicación de los segmentos lumbares (L)4-L5 de la columna vertebral
.
- Agarre el colgajo de piel expuesto con un clip de metal, que servirá como electrodo de referencia.
- Coloque una esponja empapada en solución salina en el lado dorsal de la vértebra torácica (Th) 12. Asegúrese de que el tamaño de la esponja sea igual al de un electrodo tsDCS activo (placa de acero inoxidable en forma de círculo de 5 mm de diámetro).
- Con un manipulador fino, presione la esponja con un electrodo tsDCS activo contra el hueso y asegúrese de que toda la superficie del electrodo esté presionada por igual.
- Conecte los electrodos tsDCS de referencia y activos a una unidad estimuladora de corriente constante capaz de suministrar un flujo continuo de corriente continua.
10. Preparación de micropipetas
- Con un extractor de microelectrodos, prepare un microelectrodo.
nota: Se pueden utilizar electrodos de filamento y no filamentos. Sin embargo, recuerde que el vástago del electrodo debe ser lo suficientemente largo como para alcanzar el cuerno ventral y ser lo suficientemente delgado como para no comprimir la médula espinal durante el descenso.
- Ajuste la configuración del extractor para que el vástago que ingresa a la médula espinal tenga aproximadamente 3 mm de largo, mientras que la punta del electrodo no tenga más de 1\u20122 μm de diámetro y la resistencia del microelectrodo esté entre 10 y 20 MΩ.
- Llene los microelectrodos con electrolito de citrato de potasio 2M.
- Monte el microelectrodo preparado en el micromanipulador, lo que permite un movimiento escalonado de 1 a 22 μm y una calibración estereotáxica.
- Conecte el microelectrodo al amplificador intracelular con el electrodo de referencia colocado en los músculos de la espalda.
- Después del bloqueo neuromuscular, controle la profundidad de la anestesia verificando la frecuencia del electrocardiograma (ECG) y complemente el agente anestésico para que la frecuencia cardíaca de la rata no supere las 400 lpm.
11. Seguimiento y penetración de motoneuronas
- Vuelva a colocar el electrodo de registro de descarga aferente en la superficie dorsal de la médula espinal, caudalmente hasta la ubicación del sitio de registro, a nivel del segmento L6.
- Estimula los nervios gastrocnemio medial (MG) y gastrocnemio lateral y sóleo (LGS) con pulsos eléctricos de 0,1 ms a una frecuencia de 3 Hz e intensidad 3T para activar todos los axones de las motoneuronas alfa dentro de un nervio seleccionado.
- Introduzca la micropipeta en un parche seleccionado en la pia con un ángulo mediolateral de 15\u201220° (con la punta dirigida lateralmente).
- Después de descender por debajo de la superficie, calibre el microelectrodo y compense su capacitancia y compensación de voltaje, y continúe la penetración de la médula espinal cuando todos los parámetros estén estables. Un potencial de campo antidrómico del grupo de motoneuronas será visible en la traza de voltaje del microelectrodo mientras se acerca a un núcleo motor dedicado durante la estimulación del nervio respectivo.
- Proceda a la penetración con el microelectrodo en pasos de 1-22 μm y utilice periódicamente la función de zumbido del amplificador intracelular para limpiar la punta del electrodo de cualquier residuo.
- Observe la penetración de las motoneuronas, que se caracterizará por una hiperpolarización repentina de la traza de voltaje registrada y la aparición de un potencial de pico antidrómico.
12. Registro de las propiedades de la membrana y el disparo de la motoneurona
- En un modo puente del amplificador intracelular, identifique la motoneurona basándose en la apariencia de "todo o nada" del potencial de acción antidrómica mediante la estimulación de las ramas nerviosas respectivas. Registre 20 seguimientos posteriores para promediarlos más tarde.
- Implementar un criterio de inclusión estricto para garantizar datos de alta calidad: potencial de membrana en reposo de al menos -50 mV en amplitud; amplitudes de potencial de acción superiores a 50 mV, con un rebasamiento positivo; potencial de membrana estable durante al menos 5 min antes del registro.
- En un modo de pinza de corriente discontinua (modo de velocidad de conmutación de corriente 4-8 kHz) del amplificador intracelular, evoque un potencial de acción ortodrómica en una motoneurona utilizando pulsos de corriente de despolarización intracelular de 0,5 ms. Repita al menos 20 veces para el promedio sin conexión.
- Estimula una motoneurona con 40 pulsos cortos (100 ms) de corriente hiperpolarizante (1 nA) para calcular la resistencia de entrada de la célula.
- Estimule una motoneurona con pulsos de onda cuadrada de 50 ms a amplitudes crecientes para determinar el valor de la reobase como la amplitud mínima de la corriente de despolarización requerida para provocar un solo pico.
- Inyecte pulsos de onda cuadrada de 500 ms de corriente despolarizante, a amplitudes crecientes en pasos de 0,1 a 2 nA para evocar descargas rítmicas de motoneuronas.
>13. Estimulación transespinal de corriente directa (tsDCS)
- Mientras mantiene una penetración estable de la motoneurona, inicie el procedimiento de polarización mediante la aplicación transespinal de corriente continua. Ajuste la intensidad de la corriente y el tiempo de aplicación al diseño del experimento (por ejemplo, 0,1 mA durante 15 min).
- Inmediatamente después de encender la corriente continua, observe el potencial de membrana de la motoneurona. La polarización anodal (el electrodo activo como ánodo) debería dar lugar a la despolarización del potencial de membrana, mientras que la polarización catódica (el electrodo activo como cátodo) debería evocar un efecto contrario. Observe si un cambio en el potencial de membrana en reposo en respuesta a la estimulación de CC es constante, lo que garantiza que la intensidad del campo eléctrico no se vea afectada.
- Durante la aplicación de corriente continua, repita los pasos 5.3 a 5.6 en intervalos de 5 minutos.
- Apague el controlador de dominio y continúe repitiendo los pasos 5.3 a 5.6 en intervalos de 5 minutos hasta que las grabaciones se vuelvan inestables o los criterios de inclusión se vean comprometidos.
- Finalizar el experimento y sacrificar al animal mediante la administración intravenosa de una dosis letal de pentobarbital sódico (180 mg·kg-1).
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