Aplicación de corrientes de ruido a las neuronas del núcleo vestibular medial mediante la técnica de patch-clamp de célula completa

Resumen

Fuente: Stefani, S. P., et al. Aplicación estocástica del ruido para la evaluación de la sensibilidad de las neuronas del núcleo vestibular medial in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un protocolo que implica la aplicación de corrientes de ruido subumbral a las neuronas del núcleo vestibular medial utilizando la técnica de patch-clamp de célula completa para estudiar el impacto de las corrientes de ruido en la sensibilidad neuronal a los estímulos eléctricos.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Animales

NOTA: Los ratones se obtuvieron del Centro Australiano de Roedores (ARC; Perth, Australia) y se llevó a cabo en el Medical Foundation Building Animal Facility de la Universidad de Sydney.

1. Mantenga a los ratones en un ciclo estándar de luz/oscuridad de 12 h con enriquecimiento ambiental.
2. Utilice ratones C57BL/6 machos y hembras (de 3 a 5 semanas de edad) para todos los experimentos.

>2. Preparación de soluciones

1. Prepare 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) compuesto por 29 mM de NaHCO₃, 11 mM de glucosa, 120 mM de NaCl, 3,3 mM de KCl, 1,4 mM de NaH₂PO₄, 2,2 mM de MgCl₂, 2,77 mM de CaCl₂.
2. Prepare 200 mL de sacarosa-ACSF (sACSF) que contiene 29 mM de NaHCO₃, 11 mM de glucosa, 241,5 mM de sacarosa, 3,3 mM de KCl, 1,4 mM de NaH₂PO₄, 2,2 mM de MgCl₂, 2,77 mM de CaCl₂. Antes de añadir CaCl₂ al ACSF y al sACSF, gasear las soluciones con carbógeno (95 % de_O2 y 5 % de_CO2) para establecer un pH de 7,4 y evitar la precipitación de calcio (turbidez).
3. Prepare una solución intracelular a base de K⁺ compuesta por 70 mM de gluconato de potasio, 70 mM de KCl, 2 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, 4 mM de EGTA, 4 mM de Mg 2-ATP, 0,3 mM de Na_3-GTP, con un pH final de 7,3 (ajustado mediante KOH)
   nota: Se recomienda que las soluciones intracelulares se filtren con filtros de 0,22 μm y se almacenen en alícuotas de 0,5 mL a -20 °C.

>3. Preparación del tronco encefálico

1. Antes de la extracción del tronco encefálico, equilibre el sACSF con el carbógeno y enfríe a -80 °C durante 25 minutos para formar una suspensión de hielo.
2. Anestesiar al ratón con isoflurano (3-5 %) saturado de oxígeno (3 mL/min). Una vez que los reflejos de la pata trasera estén ausentes, decapita al ratón con unas tijeras afiladas de acero inoxidable.
3. Exponga el cráneo haciendo una incisión sagital en la piel con una cuchilla de afeitar (# 22 redondeada).
4. Usando el extremo puntiagudo de un par de tijeras de patrón estándar, haga una pequeña incisión en la lambda y corte a lo largo de la fisura longitudinal.
5. Refleje cuidadosamente los huesos parietal y occipital emparejados utilizando un par de rongeurs de Pearson de flexión poco profunda.
   nota: El cerebro se baña continuamente in situ utilizando la suspensión de sACSF helada previamente preparada durante este procedimiento.
6. Aísle el tronco encefálico del prosencéfalo y su envoltura ósea con una cuchilla de afeitar (# 11 recta) para cortar el surco parieto-occipital y en la médula caudal.
7. Monte el extremo ventral aislado del tronco encefálico sobre un bloque trapezoidal de poliestireno previamente cortado. Utilice una mecha de papel de seda para eliminar el exceso de líquido alrededor del tejido diseccionado y asegurar una buena adherencia del tejido a la etapa de corte.
   nota: El bloque de poliestireno se corta en forma trapezoidal para garantizar que el extremo rostral del mesencéfalo encaje y se estreche en la médula espinal.
8. Use pegamento de cianoacrilato para fijar el bloque de poliestireno con el extremo rostral del tronco encefálico adjunto hasta la etapa de corte.
9. Utilizando una velocidad de avance de 0,16 mm/s y una amplitud de vibración de 3,00 mm, prepare cortes transversales de 200 μm del MVN.
   nota: La ubicación de la MVN se determina utilizando el atlas cerebral del ratón Paxinos y Franklin. La NMV (listada como MVe en el atlas) se encuentra inmediatamente ventrolateral al 4º ventrículo y es la más grande justo antes de la unión del cerebelo (entre los colículos inferiores y el óbex).
10. Utilice una pipeta con borde de plástico para transferir las rodajas a un disco de papel de filtro que se encuentre en ACSF carbogenado a 25 °C durante al menos 30 minutos antes de grabar.

4. Instrumentos

1. Utilice una configuración electrofisiológica estándar para realizar la técnica de pinza de parche de celda completa.
2. Prepare las micropipetas siguiendo un protocolo de dos pasos (paso de calor 1: 70; paso de calor 2: 45) en un extractor de micropipetas (consulte la tabla de materiales).
3. Cuando se colocan en el baño, las micropipetas deben tener una resistencia final que oscile entre 3 y 5 MΩ con una solución interna.
   nota: Los ajustes utilizados pueden variar en función de la temperatura dentro de la habitación y pueden cambiar con bastante frecuencia.

5. Electrofisiología de la abrazadera de parche de célula completa

1. Para obtener registros de pinza de parche de célula completa de neuronas individuales en la MVN, se utiliza una solución interna basada en K+ dentro de la pipeta de registro.
2. Transfiera un solo trozo de tejido de la cámara de incubación a la cámara de registro y asegúrelo con hilo de nailon en un peso en forma de U. Perfundir continuamente la cámara de registro con ACSF carbogenado a 25 °C a un caudal de 3 mL/min.
3. Después de llenar una micropipeta con solución interna, localice el MVN utilizando una lente de objetivo de baja potencia (10x). Usando un objetivo de alta potencia (40x), se pueden localizar neuronas individuales dentro de la MVN.
   nota: La calidad de la célula es esencial para garantizar grabaciones de calidad y durabilidad de la célula cuando se intenta lograr la configuración de célula completa. Una célula adecuada demostrará una forma esférica, una membrana celular reflectante y un núcleo invisible. Una célula inadecuada tendrá un gran núcleo visible (similar a un huevo) y una apariencia hinchada o encogida.
4. Antes de perforar el tejido con la pipeta, aplique una pequeña cantidad de presión positiva para alejar los residuos de la punta de la pipeta.
5. Mueva la pipeta con el micromanipulador hacia la neurona elegida y se formará un pequeño hoyuelo en la membrana neuronal.
   Libere la presión positiva y aplique una pequeña cantidad de presión negativa.
6. Una vez que se logra un sellado de 1 GΩ, aplique una presión negativa suave, corta y aguda al soporte de pipeta a través del puerto de succión para romper la membrana y crear una configuración de celda completa.
7. Realice registros de pinzas amperimétricas de celda completa utilizando técnicas estándar.

>6. Aplicación de ruido sinusoidal y estocástico a las neuronas individuales del núcleo vestibular medial

1. Aplique el ruido estocástico y sinusoidal en un rango de amplitudes de 3 a 24 pA para determinar el umbral neuronal y la velocidad de disparo.
2. Determine el umbral sensorial agrupando las intensidades de estímulo más bajas y más altas y realice un ANOVA para observar cualquier diferencia (como se muestra en la Figura 1).
3. Calcule la velocidad de disparo promedio durante el período de 10 s en el que se inyectó/se inyectará el paso de corriente despolarizante para cada nivel de corriente individual (es decir, 7 episodios en total; Figura 2).
4. Utilice los valores de la tasa de disparo promedio para generar una tasa de disparo en comparación con la gráfica actual y realice un análisis de regresión lineal para determinar el gradiente de la línea de mejor ajuste. El gradiente de la línea de mejor ajuste indica ganancia neuronal.

Resultados

Figura 1: Determinación objetiva del umbral de 12 pA. Las velocidades de disparo para menos de 12 pA (3 y 6 pA) y más de 12 pA (18 y 24 pA) se agruparon y promediaron. Estos promedios se analizaron mediante un ANOVA y significación estadística entre sham y >12 pA y entre <12 pA y >12 pA. *P < 0,05.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CaCl2	Scharlau	CA01951000	Se utiliza para ACSF y sACSF
D-(+)-Glucosa	sigma	G8270	Se utiliza para ACSF y sACSF
EGTA	sigma	E0396-25G	Se utiliza para soluciones intracelulares basadas en K
HEPES	sigma	H3375-25G	Se utiliza para soluciones intracelulares basadas en K
Kcl	Suministro de productos químicos	PA054-500G	Se utiliza para ACSF, sACSF y solución intracelular
K-gluconato	sigma	P1847-100G	Se utiliza para soluciones intracelulares basadas en K
Mg-ATP	sigma	A9187-500MG	Se utiliza para soluciones intracelulares basadas en K
MgCl	Suministro de productos químicos	MA00360500	Se utiliza para ACSF y sACSF
Na3-GTP	sigma	G8877-100MG	Se utiliza para soluciones intracelulares basadas en K
NaCl	Suministro de productos químicos	SO02270500	Uso para ACSF y solución intracelular
NaH2PO4.2H 2O	Ajax	AJA471-500G	Se utiliza para ACSF y sACSF
NaHCO3	sigma	S5761-1KG	Se utiliza para ACSF y sACSF
sacarosa	Suministro de productos químicos	SA030-500G	Se utiliza para sACSF
Isoflurano	Henry Schein	1169567762	Se utiliza para anestesiar ratones
equipo
Capilares de vidrio de borosilicato	Instrumentos Warner	GC150T-7.5	1,5 mm de diámetro exterior, 1,16 mm de diámetro interior, 7,5 cm largura
Software de adquisición de datos	Axógrafo		Se utiliza para electrofisiología y análisis
Friedmen-Pearson Rongeurs	Instrumentos de precisión mundial	14089	Se utiliza para la disección
Extractor de micropipetas	Narishige	PP-830	Se utiliza para micropipeta
Amplificador Multiclamp	Instrumentos Axon	700B	Se utiliza para electrofisiología
Medidor de pH	Sper científico	860033	Se utiliza para la solución interna
Tijeras de patrón estándar	FST	14028-10	Se utiliza para la disección
Micromanipulador Sutter	Sutter	MP-225/M	Se utiliza para electrofisiología
Microscopio vertical	Olimpo	BX51WI	Se utiliza para electrofisiología
Vibratomo	Leica	VT1200	Se utiliza para cortar el tejido cerebral