Detección de niveles de peróxido de hidrógeno en neuronas cultivadas a través de imágenes de fluorescencia de células vivas

Resumen

Fuente: Terzi, A. et al., ROS Imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal.J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra una técnica para detectar niveles de peróxido de hidrógeno en tiempo real en células ganglionares de la retina utilizando el biosensor roGFP2-Orp1 y técnicas de imagen de células vivas. Describe los pasos involucrados en la preparación de células, las imágenes de fluorescencia y la cuantificación de los niveles de peróxido de hidrógeno.

Protocolo

>1. Imágenes in vitro de especies reactivas de oxígeno (ROS) de neuronas de células ganglionares de la retina (RGC) cultivadas

1. El día de la toma de imágenes (por lo general, de 6 a 24 horas después de la siembra de células), observe las células ganglionares de la retina bajo un microscopio para validar el crecimiento de los axones RGC.
2. Para la obtención de imágenes de células vivas, transfiera los cubreobjetos de la placa de cultivo a una cámara de imágenes de células vivas.
3. Configure el microscopio para la obtención de imágenes. Utilice un microscopio invertido equipado con un objetivo de contraste de interferencia diferencial (DIC), un filtro rojo de paso largo OG590 y una cámara EM-CCD.
4. Antes de la toma de imágenes, reemplace el medio de cultivo de células de pez cebra con suero y antibióticos (ZFCM)(+)) por medio de cultivo de células de pez cebra sin suero y antibióticos (ZFCM(-)).
5. Una vez que las celdas se colocan con un objetivo de 10x, adquiera imágenes con un aumento de 60x utilizando un objetivo de inmersión en aceite de alta NA. Utilice un aumento adicional de 1,5x.
6. En primer lugar, adquiera imágenes DIC. A continuación, fotografíe roGFP2-Orp1 utilizando un conjunto de filtros adecuado. Excite roGFP2-ORP1 con filtros de excitación de 405/20 y 480/30 nm secuencialmente y adquiera imágenes con un filtro de emisión de 535/30 nm después de que la luz de emisión haya pasado por el espejo dicroico 505DCXR.
7. Después de tomar el primer conjunto de imágenes, intercambie los medios con los medios que contengan diferentes soluciones de tratamiento. Los medios deben cambiarse cada 30 minutos de obtención de imágenes para evitar cambios en el pH y la osmolaridad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo de 35 mm	Sarstedt	83-3900
Cubreobjetos	Corning	Artículo 2850-22
Placas de Petri desechables (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Suero Fetal Bovino	ThermoFisher Scientific	26140087
Microscopio invertido	Nikon	TE2000
Laminina	ThermoFisher Scientific	23017-015
Leibovitz's L-15 Medium con rojo fenol	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium sin rojo fenol	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Rojo de fenol	Sigma Aldich	P0290
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma Aldich	P7280
Filtro Steritop de 0,22 μm	Millipore	S2GPT05RE
Cloruro de calcio dihidratado	Fisher Científico	C79-500
glucosa	Sigma Aldrich	G7528
HEPES	Sigma Aldrich	H4034