Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por la revisión ética animal apropiada.
1. Preparación preliminar (opcional: preparar con 1 día de anticipación)
- Prepare tres tipos de solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, por sus siglas en inglés) (Normal, Sacarosa y Soluciones de Recuperación, de 1 L cada una; ver Tabla 1). Ajuste la osmolalidad de las soluciones a 300 ± 10 mOsm y enfríe la sacarosa ACSF hasta un punto cercano al punto de congelación (0-4 °C).
nota: El uso de una solución de corte baja en sodio (ACSF-Sacarosa) ayuda a preservar la viabilidad de las neuronas en las capas superficiales de los cortes agudos.
- Prepare 0.75 mL de solución de parche que contenga un fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594) y un indicador de calcio sintético verde (por ejemplo, Oregon Green BAPTA-1; ver Tabla 1). Incluir biocitina (ver Tabla 1) en la solución parche si se requiere la identificación morfológica post hoc de las células registradas.
- Ajuste la osmolalidad de la solución a 280 ± 5 mOsm y el pH a 7,35 ± 0,5. Mantenga la solución en el refrigerador o en hielo en todo momento.
nota: La elección del indicador de calcio debe basarse en su rango dinámico y en la naturaleza de los eventos de Ca2+ investigados.
- Con un extractor de micropipetas, prepare pipetas de parche a partir de capilares de vidrio de borosilicato (consulte la tabla de materiales) con una punta de ≈ 2 μm (resistencia de pipeta de 3-5 MΩ) y pipetas de estimulación a partir de capilares de borosilicato theta-glass (consulte la tabla de materiales) con una punta de 2-5 μm.
nota: Los ajustes del extractor para fabricar pipetas de un diámetro y forma determinados vendrán determinados por el tipo de filamento del extractor y los resultados de la prueba de rampa para un tipo de vidrio determinado.
2. Grabaciones de patch-clamp de celda completa
- Coloque un corte del hipocampo en su lugar en un baño colocado debajo del objetivo (aumento: 40x, apertura numérica: 0,8) de un microscopio de dos fotones de barrido láser. Perfundir continuamente el baño con ACSF-Normal oxigenado calentado a 30-32 °C a una velocidad de 2,5-3 mL/min.
- Utilice el contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC) o la microscopía Dodt-SGC para localizar una célula de interés utilizando su tamaño, forma y posición.
nota: Dependiendo de la población de neuronas objetivo, se puede utilizar un modelo de ratón transgénico para localizar fácilmente las células de interés. En este caso, este paso puede sustituirse por el uso de una fuente de luz fluorescente.
- Llene una pipeta de estimulación con una solución ACSF-Normal que contenga el fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594).
- Coloque la pipeta de estimulación (conectada a una unidad de estimulación eléctrica) en la parte superior del corte de modo que la punta esté en la misma región que la celda de interés.
- Después de llenar la pipeta de parche con solución de parche y colocarla en una platina de cabeza, colóquela sobre la rebanada de modo que su punta quede directamente sobre la celda de interés.
- Coloque una jeringa en una llave de paso de tres vías y conéctela a la pipeta de parche a través del tubo de plástico. Inyecte presión positiva constante en la pipeta de parche (≈ 0,1 ml) con la jeringa. Mantenga la llave de paso en una posición "cerrada".
- Active el módulo de software de control del amplificador y cambie al modo de pinza de voltaje haciendo clic en el botón "VC". Abra el software de adquisición de datos electrofisiológicos (por ejemplo, clampex) para la adquisición de señales electrofisiológicas y haga clic en el icono "Prueba de membrana" para que envíe continuamente un pulso de voltaje cuadrado (5 mV, 10 ms), que es necesario para controlar los cambios en la resistencia de la pipeta.
- Baje la pipeta de parche hasta que quede justo encima de la célula objetivo. Al entrar en contacto con la membrana celular, elimine la presión girando la llave de paso a la posición "abierta><".
nota: El contacto con la membrana celular se detecta cuando se observa un pequeño aumento en la resistencia de la pipeta (≈ 0,2 MΩ) y una pequeña hendidura en la celda es causada por la presión positiva.
- Aplique una ligera presión negativa a la pipeta de parche con una jeringa vacía instalada en la llave de paso hasta que la resistencia de la pipeta proporcionada por el software alcance 1 GΩ. En la ventana "Prueba de membrana" del software de adquisición de datos, sujete la celda a -60 mV.
- Continúe aplicando presión negativa hasta que se abra la celda y se logre la configuración de celda completa. La detección de este estado de la célula se basa en el cambio repentino en la resistencia de la pipeta (de 1 GΩ a 70-500 MΩ dependiendo del tipo de interneurona) y la aparición de grandes transitorios capacitivos en la ventana de 'Prueba de membrana'.
3. Imágenes de calcio (Ca2+) de dos fotones
- Si está interesado en las respuestas postsinápticas excitatorias, añada el bloqueador del receptor GABAA gabazina (10 μM) y el bloqueador del receptor GABAB CGP55845 (2 μM) al baño ACSF.
- En el módulo de software de control del amplificador, ajuste la configuración del parche a pinza de corriente haciendo clic en el botón "CC" y registre el patrón de disparo de la celda en respuesta a inyecciones somáticas de corriente despolarizante (0,8-1,0 nA, 1 s). Espere al menos 30 minutos para que la celda se llene con los indicadores presentes en la solución de parche.
nota: El patrón de disparo y las propiedades activas de la célula se pueden utilizar para identificar su subtipo, por ejemplo, células de pico rápido. Es importante que la concentración del indicador se estabilice a través de la difusión antes de comenzar a registrar los transitorios de calcio (CaTs) (consulte la Tabla 2 para la resolución de problemas).
- CaTs evocados por AP
- Con el software de adquisición de imágenes, comience a adquirir imágenes. Localice una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja. Para garantizar una respuesta visible, primero elija una dendrita proximal (≤ 50 μm), ya que la eficiencia de la retropropagación de AP puede disminuir significativamente con la distancia en las interneuronas GABAérgicas.
- Con la "herramienta rectangular" del software de adquisición de imágenes, amplíe la región objetivo y cambie al modo "xt" (escaneo lineal). Coloque el escaneo a lo largo de la rama dendrítica de interés. Con los controladores de intensidad láser en el software de adquisición, configure el láser de dos fotones a un nivel de potencia mínimo donde la fluorescencia verde de referencia sea ligeramente visible para evitar la fototoxicidad.
- En la ventana "Protocolo" del software de adquisición de datos de electrofisiología y en el software de adquisición de imágenes, cree una prueba de grabación de la duración deseada que contenga una inyección de corriente somática de la amplitud deseada.
- Usando el software de adquisición de imágenes, haga clic en el botón "Iniciar grabación" y adquiera la fluorescencia continuamente durante 1-2 s. Repita la adquisición de imágenes de 3 a 10 veces. Espere al menos 30 segundos entre exploraciones individuales para evitar el fotodaño. Si adquiere escaneos de línea en varios puntos a lo largo de una dendrita, tómelos en orden aleatorio para evitar efectos de orden.
- CaTs evocados sinápticamente
- Localice una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja.
- Coloque la pipeta de estimulación en la superficie de la rebanada por encima de la dendrita de interés. Baje lentamente la pipeta de estimulación en su lugar, minimizando el movimiento para evitar perturbar la configuración de toda la célula. Coloque la pipeta a 10-15 μm de la dendrita.
- Para visualizar la ubicación de los microdominios sinápticos en dendritas espinosas, en el software de adquisición de imágenes, cambie al modo 'xt' (escaneo lineal) y coloque la línea a lo largo de la rama dendrítica de interés.
- En la ventana "Protocolo" (del software de adquisición de datos de electrofisiología) y en el software de adquisición de imágenes, cree una prueba de grabación que active la unidad de estimulación después del inicio de la prueba.
- Usando el software de adquisición, haga clic en el botón "Iniciar registro" para escanear a lo largo de la dendrita continuamente durante 1-2 s. Repita la adquisición de 3 a 5 veces, esperando 30 s entre escaneos para evitar fotodaños.
nota: La duración de la exploración se puede ajustar en función de la cinética del evento evocado, pero debe minimizarse para evitar el fotodaño (consulte la Tabla 2 para la resolución de problemas).
- Repita el paso 3.4.5 en diferentes condiciones (p. ej., diferente intensidad/duración de la estimulación, introducción de un bloqueador farmacológico, etc.) dependiendo de la pregunta específica que se esté abordando.
- Detenga la adquisición cuando la célula muestre signos de deterioro de la salud: despolarización por debajo de -45 mV, aumento en el nivel basal de Ca2+, deterioro morfológico de las dendritas (p. ej., ampollas, fragmentación; consulte la Tabla 2 para la resolución de problemas).
- Para obtener información preliminar sobre la morfología de la célula y mantener un registro de la ubicación de la pipeta de estimulación, adquiera una pila Z de la célula en el canal rojo. Usando el software de adquisición en modo 'xyz', establezca los límites de pila superior e inferior para crear una imagen de toda la celda con todos los procesos incluidos. Establezca el "tamaño del paso" en 1 μm e inicie la adquisición de la pila con el botón "Iniciar registro".
- Cuando se complete la adquisición de la pila Z, utilice la opción "Proyección máxima" en el software para superponer todos los planes focales de la pila y verificar la calidad de la adquisición. A continuación, retraiga lentamente la pipeta de parche para sacarla de la rebanada.
- Para fijar la rebanada para la identificación morfológica post hoc, retire rápidamente la rebanada del baño con un pincel plano y colóquela entre dos papeles de filtro en una placa de Petri llena de ACSF. Sustituya el ACSF por una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% y deje el plato en una habitación o en el frigorífico a 4 °C durante la noche.
Tabla 1: Recetas de solución. Compuestos y concentraciones de las soluciones utilizadas durante el protocolo.
| solución | componente | Concentración (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | Artículo 124 |
| Kcl | 2.5 |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | número arábigo |
| NaHCO3 | 26 |
| glucosa | 10 |
| CaCl2 | número arábigo |
| ACSF-Recovery | NaCl | Artículo 124 |
| Kcl | 2.5 |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 3 |
| NaHCO3 | 26 |
| glucosa | 10 |
| CaCl2 | 1 |
| ACSF-Sacarosa | Kcl | número arábigo |
| NaH2PO4 | 1.25 |
| MgSO4 | 7 |
| NaHCO3 | 26 |
| glucosa | 10 |
| sacarosa | Artículo 219 |
| CaCl2 | 1 |
| K+-based Solución de parches | K+-gluconato | 130 |
| HEPES | 10 |
| MgCl2 | número arábigo |
| Fosfocuratina di(tris)sal | 10 |
| ATP-Tris | número arábigo |
| GTP-Tris | 0.2 |
| Biocitina | 72 |
| Alexa-594 | 0.02 |
| Oregón Verde-BAPTA-1 | 0.2 |
Tabla 2: Tabla de solución de problemas. Soluciones a problemas comunes que pueden surgir durante un experimento de imágenes de Ca2+.
| problema | solución |
| Incapaz de parchear una neurona sana | Compruebe si hay signos de que las rodajas no están sanas: células encogidas o hinchadas, núcleos visibles, etc. Si es así, desecha las rodajas. Verifique también la resistencia de la pipeta de parche y la osmolalidad de la solución de parche; Reemplácelos si los valores no están en el rango adecuado. |
| La señal de fluorescencia de las dendritas es baja | Espere más tiempo para que la celda se llene. Si una obstrucción impide que la solución del parche se difunda en la célula, intente aplicar una pequeña cantidad de presión negativa en la pipeta del parche. |
| La estimulación eléctrica no evoca una respuesta de Ca2+ | Comprobar la presencia de un artefacto en el registro electrofisiológico. En caso de ausencia, compruebe si hay un cortocircuito/mal funcionamiento de la unidad de estimulación. Si está presente, aumente la intensidad de la estimulación o acerque la pipeta de estimulación a la dendrita. Cabe señalar que la distancia entre el electrodo de estimulación y la dendrita no debe exceder los 8 mmm para evitar la despolarización directa de las dendritas al estudiar las respuestas sinápticas. |
| La señal evocada de Ca2+ es demasiado alta/satura el indicador de Ca2+ | Reducir la potencia del láser. Si el problema persiste en varias celdas, utilice un indicador Ca2+ diferente con una afinidad Ca2+ más baja. |
| La señal de Ca2+ de referencia aumenta gradualmente durante el experimento | Espere un período más largo entre exploraciones individuales. Si la línea de base sigue aumentando, detenga la adquisición; Indica que es probable que la salud de la célula esté disminuyendo. |
| La amplitud de la señal de Ca2+ disminuye durante las exploraciones | Reduzca la potencia del láser o aleje el zoom (si corresponde). |
| La dendrita se fragmenta ("blebbing") después de la exploración | Reduzca la potencia del láser o aleje el zoom. Si el blebbing se limita a la dendrita objetivo, elija otra dendrita y reduzca la potencia del láser/aleje. Si varias dendritas están floreciendo, detenga la adquisición. |
| Las señales de fluorescencia se "desvían" de la línea de escaneo después de los barridos | Reducir el movimiento en el corte al reducir la velocidad de perfusión de ACSF. Antes de parchear, asegúrese de que la rebanada esté firmemente fijada en su lugar por una red. |
