Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Montaje de la pipeta de inyección-grabación
- Tire de un capilar de vidrio de aproximadamente 7 cm de largo (1 mm de diámetro exterior) con un extractor de pipetas.
- Rompa la punta capilar y verifique la apertura bajo un microscopio óptico. Confirme que el diámetro interior esté entre 30 μm y 40 μm.
- Inserte un alambre de plata de 7 cm de largo en el capilar de vidrio con aproximadamente 1 cm que sobresalga del extremo no cónico de la pipeta de vidrio.
- Dobla el exceso de filamento ortogonalmente al capilar de vidrio.
- Aplique una gota de adhesivo plástico flexible en el eje de una aguja hipodérmica de 30 G.
- Inserte una aguja hipodérmica de 30 G en la pipeta de vidrio de acuerdo con los esquemas presentados en la Figura 1.
- Añada una segunda capa de pegamento para asegurar un sellado adecuado de la unión entre la pipeta de vidrio y la aguja hipodérmica.
- Deje que la pipeta se seque con la punta hacia arriba durante unas 12 horas para garantizar un curado adecuado del pegamento. El resultado final se muestra en la Figura 2.
NOTA: Este procedimiento se realiza en experimentos agudos y no se requiere esterilización de la punta de la pipeta.
>2. Preparación animal
- Coloque a la rata en una caja de anestesia.
- Inducir la anestesia con isoflurano al 4% durante 5 a 10 min.
- Coloque al animal en una mesa estereotáxica con una almohadilla térmica y una sonda rectal para mantener una temperatura corporal de 37 °C. Utilice un cono nasal con isoflurano al 2% para mantener la anestesia. Asegura la cabeza de la rata con barras para los oídos y un soporte para los dientes.
- Aplique ungüento oftálmico o gotas para los ojos, incluidas gotas de atropina al 1%, para ayudar en la dilatación de la pupila. Para evitar la sequedad, aplique gotas lubricantes aproximadamente cada 30 minutos.
- Afeitar la cabeza y limpiarla con un 10% de povidona yodada.
- Para la anestesia local, inyecte 0,5 ml de lidocaína al 2% debajo del cuero cabelludo en 2-3 lugares levantando la piel e insertando la punta de la aguja.
- Confirme un nivel adecuado de anestesia realizando un pellizco en los dedos de los pies y observando la falta de movimiento. Además, se debe monitorizar la frecuencia cardíaca para asegurarse de que está dentro de los valores normales (300 a 400 latidos/min).
- Incida el cuero cabelludo en línea recta a lo largo de la mediana con una hoja de bisturí #10 para exponer las suturas coronales y sagitales.
- Revele los puntos Lambda y Bregma empujando a un lado el tejido que cubre el cráneo con una espátula quirúrgica.
- Nivele el cráneo de modo que las posiciones Bregma y Lambda estén en el mismo plano.
- Para establecer el punto de referencia, use un dispositivo estereotáxico con un tubo de vidrio montado para colocarlo justo encima de Bregma. Este será el "cero" para las coordenadas de medición anteroposterior y medial-lateral.
- Establezca el punto de interés moviendo la montura estereotáxica a las coordenadas requeridas, observe las coordenadas estereotáxicas y dibuje un cuadrado alrededor del área objetivo que marque dónde se realizará la craneotomía.
- Use un taladro quirúrgico con un taladro esterilizado a lo largo del cuadrado marcado lentamente sin presión para eliminar el material óseo. Tenga cuidado de no perforar demasiado tiempo en la misma área, ya que producirá calor y causará lesiones en la corteza.
- Cuando el hueso que delimita la craneotomía se haya adelgazado lo suficiente, retire cuidadosamente la sección craneal con pinzas para exponer la corteza.
- Irrigar frecuentemente la corteza expuesta con líquido cefalorraquídeo artificial para prevenir la desecación del tejido.
nota: La extracción de la duramadre es innecesaria en la rata, ya que la punta del inyector es lo suficientemente resistente como para penetrar.
>3. Llenado y montaje del sistema de inyección
- Llene la microjeringa de 5-10 μl por aspiración con aceite mineral.
- Llene la aguja hipodérmica con la pipeta de vidrio fija con una solución de Chicago Sky Blue (CSB) al 0,5% y 300 μM de ácido γ-aminobutírico (GABA) o una solución de lidocaína al 2% con CSB 9 al 0,5%. Diluya todas las soluciones con solución salina.
- En el caso de una sustancia abundante, llene con una jeringa normal y utilice las técnicas preventivas habituales para evitar la formación de burbujas de aire.
- En el caso de sustancias más caras, se puede usar aceite mineral para llenar el inyecturo, y luego se puede introducir el agente químico por aspiración. La diferencia de densidad entre el aceite mineral y el agua es relativamente alta, por lo que esta sustancia es un buen candidato para inyectar soluciones acuosas.
nota: Se puede añadir un colorante para confirmar la separación entre ambos líquidos.
- Para llenar la pipeta inyectable, aspire una jeringa de 1 ml con la solución e inyéctela lentamente en la pipeta.
- Preste mucha atención a las fugas en las regiones indicadas en la Figura 1 limpiando estas áreas con un hisopo y observando las fugas inyectando la solución lentamente con la jeringa.
- Retire la jeringa de 1 ml. Al hacerlo, mantenga una ligera presión sobre el émbolo para que el vacío no elimine la solución de la pipeta de inyección.
- Aspire la microjeringa con aceite mineral y fíjela firmemente a la pipeta de inyección llena. A continuación, limpie con cuidado el exceso de solución del inyecturo montado con una gasa.
- Inyecte un volumen muy pequeño, suficiente para ver cómo se forma una pequeña gota en la punta de la pipeta de vidrio, para verificar que la punta no esté bloqueada.
- Monte el inyector en el sistema de microbomba y asegúrese de que esté bien fijado.
- Coloque con cuidado la punta del inyector en las coordenadas objetivo y baje la punta hasta la superficie de la corteza.
- Bajar lentamente el inyecturo utilizando el aparato estereotáxico hasta la estructura diana (colículo superior) utilizando las coordenadas anatómicas adecuadas.
- Cubra la corteza expuesta con agar tibio para evitar la desecación del tejido.
>4. Inyección e inactivación reversible
- Configure la bomba de microinyección para inyectar de 400 a 800 nl a 40 nl/min y presione Run para iniciar la inyección. Tenga en cuenta que la tasa de pico mostrará una reducción durante la inyección.
NOTA: En la configuración experimental, la actividad neuronal se recuperó dentro de una hora después del final de la administración de GABA. Se puede utilizar cualquier dispositivo mecánico calibrado para aplicar presión a la jeringa de microinyección y realizar la inyección.
- Después de adquirir los datos electrofisiológicos, eutanasia utilizando un método aprobado por la Comunidad de Ética Animal local.
