Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de soluciones
- Preparar 500 mL de líquido cefalorraquídeo artificial estándar (ACSF, por sus siglas en inglés) que contenga los componentes descritos en nuestro trabajo publicado, tal como se enumeran en la Tabla 1.
- Use vasos de precipitados de vidrio limpios con agua desionizada para preparar una solución fresca de ACSF. Limpie las espátulas con agua desionizada y séquelas antes de usar para agregar cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), fosfato de sodio dihidrógeno (NaH2PO4), bicarbonato de sodio (NaHCO3), sulfato de magnesio (MgSO4), D-glucosa y agregue el cloruro de calcio (CaCl2) después de haber burbujeado la solución con 95% O2 / 5% CO2mezcla para ~ 20 min (como se detalla en la Tabla 1) a 500 mL de agua desionizada. Revuelva hasta que se disuelva por completo.
- Asegúrese de que el ACSF esté completamente despejado sin precipitaciones. A continuación, ajusta el pH a 7,2-7,4. Burbuja con una mezcla de gases compuesta por 95% deO2 y 5% de CO2 durante ~20 min.
- Prepare 250 mL de solución para cortar rodajas que contenga los productos químicos descritos en la Tabla 2.
- Añadir KCl, cloruro de magnesio (MgCl2), NaH2PO4, NaHCO3, colina·Cl y D-glucosa y añadir el cloruro de calcio (CaCl2) en último lugar como se indica en 1.1.1, a 250 mL de agua desionizada y disolver como se describe en 1.1.1 y 1.1.2.
- Después de burbujear con 95% O2/5% CO2, coloque la solución en un congelador durante 15-20 minutos para que la solución de corte se enfríe como el hielo y se congele parcialmente><.
nota: Utilizamos esta solución de corte cuando hacemos rodajas de ratones de 1-2 meses de edad; La fórmula puede diferir para ratones mayores de 2 meses.
- Prepare una solución de lipopolisacárido (LPS) disolviéndola en solución salina isotónica estéril libre de endotoxinas (NaCl al 0,9%). El LPS se administra por vía intraperitoneal (0,5 mg/kg) y comienza el registro 2 h después.
>2. Preparación del corte de la corteza prefrontal
- Saca la solución de corte del congelador y homogeneiza para obtener un granizado. Coloque la solución en hielo y burbujee constantemente con 95% O2/5% CO2.
- Con unas tijeras grandes y afiladas, decapita rápidamente a un ratón como se describe e inmediatamente coloca la cabeza en un vaso de precipitados lleno de solución de corte helada (0-4 °C).
- Corta la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media en dirección caudal a nasal con unas tijeras finas y retira las partes laterales del cráneo. Retire el cerebro con una espátula fina y colóquelo en una solución de corte helada.
nota: Los pasos 2.2-2.3 deben realizarse rápidamente (idealmente < 1 min).
- Coloque el cerebro en la tapa de una placa de Petri de 9 cm llena de hielo. Enjuague el cerebro con una solución de corte helada. Corta el cerebelo y el bulbo olfativo con una cuchilla de afeitar.
- Aplique pegamento de cianoacrilato al portamuestras de un vibrátomo. Coloque con cuidado el bloque cerebral sobre la gota de pegamento, con el lado rostral hacia arriba, e inmediatamente sumérjalo en una solución de corte helada.
- Ajuste el soporte de la cuchilla del vibratomo a un ángulo de 15° con respecto al plano horizontal y prepare cortes de cerebro coronal de 350 μm (frecuencia de vibración de la cuchilla = 85 Hz, velocidad = 0,1 mm/s).
- Con una pipeta, transfiera las rodajas a la cámara de recuperación llena de ACSF, incube durante 1 h (a RT) con un burbujeo constante de 95% O2/5% CO2.
>3. Grabación de parches de celda completa
- Fabrica micropipetas de borosilicato de vidrio para su uso como electrodos de registro o micropipetas de soplo de acuerdo con las directrices específicas del Manual de funcionamiento del extractor. Para los electrodos de registro, las resistencias de la punta están en el rango de 4-6 MΩ, mientras que las micropipetas de puff tienen diámetros de punta en el rango de 2-5 μm.
- Añadir un bloqueador de canales de Na+ (tetrodotoxina (TTX), 1 μM), para bloquear el canal rápido de Na+ y, por tanto, los potenciales de acción, a la ACSF y mantener un caudal constante de esta solución de 2-3 mL/min en la cámara de registro, mediante una bomba peristáltica en la cámara y aspiración fuera de ella. Burbujee el ACSF con 95% O2/5% CO2 constantemente para garantizar la viabilidad de las rodajas.
- Transfiera un trozo de cerebro a la cámara de grabación utilizando una pipeta Pasteur modificada cuya punta fina se cortó para adaptarse al tamaño de la rebanada. Cubra la rebanada con un anclaje de loncha de platino con hilos de nailon paralelos espaciados a ≥2 mm de distancia para sujetar la rebanada en la plataforma.
- Llene la micropipeta de registro con solución interna (Tabla 3) y llene las micropipetas de soplo con ácido gamma-aminobutírico (GABA) a 10 μM, 50 μM y 100 μM (disuelto en ACSF), o ACSF como control del vehículo.
- Para evitar la obstrucción con residuos, aplique una ligera presión positiva con una jeringa de 1 ml antes de sumergir el electrodo de registro en el ACSF. Usando un micromanipulador debajo de un microscopio (lente de objetivo 4x), coloque el electrodo de registro y la micropipeta de soplo de modo que las puntas aparezcan en el centro de la imagen de video en el monitor (Figura 1A).
- Ajuste el enfoque del microscopio (lente del objetivo de 40x) mientras baja gradualmente la micropipeta de puff y colóquela sobre la neurona registradora en un ángulo de 45°. Mantenga la distancia entre la punta de la micropipeta puff y la neurona registrada entre 20-40 μm (Figura 1B). Acérquese lenta y cuidadosamente a la neurona con el electrodo de registro y luego libere la presión positiva. Aplique una succión débil y breve a través del tubo conectado al portaelectrodos para crear un sello de giga-ohmios.
- Mantenga el voltaje a 0 mV. Después de la formación del sello de giga-ohmios, compense la capacitancia rápida y lenta de forma manual o automática. A continuación, aplique una succión breve y fuerte a través del tubo mencionado anteriormente para entrar en el modo de célula completa.
- Registre eIPSC en modo de pinza de voltaje. Aplique baja presión de gas (nitrógeno, 4 - 6 psi) a la micropipeta de puff utilizando un Picospritzer controlado por un generador escalonado de voltaje Master 8 para producir puffs de GABA individuales o emparejados (Figura 2).
Tabla 1. Grabación ACSF.
| sustancia | g/mol | Concentración (mM) | Peso (g/L) |
| NaCl | 58.443 | Artículo 119 | 6.9547 |
| Kcl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1 | 0.1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | Artículo 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0.1565 |
| D-glucosa | Artículo 198.17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0.2775 |
Tabla 2. Solución de corte en rodajas.
| sustancia | g/mol | Concentración (mM) | Peso (g/L) |
| Kcl | 74.551 | 2.5 | 0.1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Colina·Cl | 139.63 | Artículo 115 | 16.0575 |
| D-glucosa | Artículo 198.17 | 7 | 1.3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0.5 | 0.0555 |
Tabla 3. Solución interna para grabaciones de parches de celda completa.
| sustancia | g/mol | Concentración (mM) | Peso (g/L) |
| Gluconato de Cs | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168.36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2.3830 |
| MgCl2 | 95.211 | número arábigo | 0.1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0.1110 |
| BAPTA | 476.433 | 11 | 5.2408 |
| Na2ATP | Artículo 551.1 | 4 | 2.2044 |
| Na2GTP | Artículo 523.2 | 0.4 | 0.2093 |
