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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Soluciones Externas e Internas
- Utilice la solución de Ringer en mamíferos durante la disección de la retina y como solución externa en el registro electrofisiológico posterior. Prepare la solución de Ringer de mamíferos a partir de 10 veces la solución madre (sin calcio) el día del registro, y agregue CaCl2 gota a gota después de 15 minutos de carbogenación (95% deO2 y 5% de CO2). La solución final 1x contiene (en mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2HPO4, 0,1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 y 10 D-glucosa.
- Utilice dos soluciones internas para caracterizar las oscilaciones de SAC. Pruebe la utilidad de las soluciones preparadas en registros prolongados de pinzamiento de parches de células enteras en células ganglionares de la retina (RGC) de ratones adultos y almacene los lotes verificados en alícuotas de 500 μl a -20 °C hasta su uso.
- Para registrar la oscilación del potencial de membrana, utilice una solución interna a base de potasio que contenga (en mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4-trifosfato de adenosina (ATP)-Mg, 0,5 trifosfato de li-guanosina (GTP), ácido tetraacético 5-etilenglicol (EGTA), 10 ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) y 0,2% de biocitina (p/v). Ajusta el pH a 7,3 con KOH.
- Para registrar las corrientes postsinápticas excitadoras e inhibidoras, utilice una solución interna a base de cesio que contenga (en mM): 100 Cs-metanosulfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES y 0,2% de biocitina (p/v). Ajuste el pH a 7.3 con CsOH.
>2. Preparación para el día de la grabación
- Para preparar una membrana de nitrocelulosa con orificios abiertos, perfore manualmente la membrana con un perforador personalizado hecho con una aguja de jeringa de 16 G desafilada y aplane la membrana entre dos placas de vidrio limpias. Para una retina de montaje completo, haz un orificio central de 0,2 mm de diámetro y rodéalo por 4 orificios más grandes de 1-1,2 mm de diámetro.
- Para hacer un filamento de relleno personalizado para cargar la solución interna en los electrodos, derrita una punta de pipeta de 10 μl en el medio y alargue suavemente la parte derretida hasta que se enfríe y endurezca. Justo antes de usar, use una hoja de afeitar limpia para recortar el filamento hasta que sea un poco más largo que las pipetas del parche.
- Extraiga pipetas de parche en un extractor programable de un tubo de vidrio de borosilicato con un filamento interno. Fabrica las micropipetas el día del experimento y úsalas inmediatamente.
nota: Para registrar los SAC, utilizamos la siguiente configuración del extractor: calor: 484; tirón: 0; velocidad: 25; tiempo de retardo: 1; presión: 400 y un valor de rampa de 462. El diámetro exterior (O.D.) y el diámetro interior (I.D.) de los tubos de borosilicato son de 1,65 mm y 1,0 mm, respectivamente. La resistencia de las pipetas es de 10-14 MΩ.
- Una hora antes de la recolección de tejidos, descongele un tubo de solución interna agitándolo en un vórtice durante >30 min.
3. Disección de retina
- Anestesiar al animal con un 4% de isoflurano en oxígeno hasta que el animal pierda la capacidad de respuesta a un pellizco en el dedo del pie. Sacrificar al animal por luxación cervical.
- Corte ambos globos oculares de los nervios ópticos a una distancia de 1-2 mm de las cabezas de los nervios ópticos con unas tijeras de iris de punta recta.
- Haga rodar los globos oculares sobre una toalla de papel limpia para eliminar la sangre y luego sumérjalos en la solución de Ringer de mamíferos carbengenados. Perfore un agujero en el limbo con una aguja de 23 g y divida los globos oculares cortando a lo largo del limbo con microtijeras. Retire la córnea y el cristalino con pinzas finas.
- En el caso de la retina entera, despegue suavemente toda la retina del epitelio pigmentado con pinzas finas y haga cuatro cortes ortogonales de 1,5-2 mm desde el borde hacia la cabeza del nervio óptico.
- Sumerge una membrana de nitrocelulosa perforada en la placa y arrastra suavemente la retina sobre ella con la capa de células ganglionares (GCL) hacia arriba. Coloque la cabeza del nervio óptico en el orificio central cuando prepare una retina de montaje completo. Transfiera la membrana con la retina a otro plato limpio. Aplana suavemente la retina con un pincel fino para que parezca una cruz de Malta y coloca los cuatro bordes sobre los agujeros.
- Si se va a examinar una fracción de la retina a la vez, corte cada ocular preparado a partir del paso 3.3 en 3-4 piezas con una cuchilla de afeitar con los restos de epitelio pigmentado adheridos. Proteja las piezas no utilizadas de la luz en una solución externa carbogenada y utilícelas dentro de las 12 horas.
- Seque la membrana de nitrocelulosa con un trozo de papel de filtro seco y retire la membrana limitante vítrea e interna con pinzas y un pincel.
- Asegúrese de que todos los bordes de la retina estén completamente unidos a la membrana antes de transferir el conjunto a la cámara de grabación con un cubreobjetos de vidrio sellado en la parte inferior. Asegure la membrana con grasa de vacío al cubreobjetos y rehidrate la retina con la solución externa. Tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo del conjunto.
- Coloque la cámara en la platina de un microscopio vertical. Perfundir la cámara con una solución externa carbogenada tibia (34-35 °C) a una tasa de ~3 ml por minuto.
- Examine primero la retina con una lente de objetivo de 10x y, a continuación, utilice una lente de inmersión en agua de 60x para ver las neuronas GCL y de la capa nuclear interna (INL) con contraste de interferencia diferencial (DIC) y/o epifluorescencia. Para visualizar los SAC que expresan tdTomato, utilice una fuente de luz de diodo emisor de luz (LED) blanca en combinación con un filtro de excitación de 554 nm y un filtro de emisión de 581 nm.
>4. Grabación de Patch Clamp de celda completa desde Retina de montaje plano
- Filtre la solución interna a través de un filtro de jeringa en el filamento de relleno personalizado.
- Inserte el filamento en una micropipeta recién extraída y dispense la solución interna cerca de la punta hasta que la solución cubra el alambre del electrodo de plata durante >5 mm. Fije la micropipeta a un portaelectrodos con un poste de succión, a través del cual se puede ajustar la presión dentro del electrodo empujando o tirando del émbolo de una jeringa de plástico de 10 ml conectada a un tubo.
- Encuentre la pipeta debajo del objetivo y bájela a ~100 μm por encima de la retina. En el modo de seguidor de corriente (I = 0), utilice el desplazamiento de CC para poner a cero la señal de voltaje de CC permanente. Mida la resistencia de la pipeta en el modo de pinza amperimétrica (IClamp) inyectando corrientes de onda cuadrada de amplitud fija a través de la pipeta mientras está en el baño y neutralice la diferencia girando la perilla Raccess. Utilice la lectura de la perilla Raccess para calcular la resistencia de la pipeta según la ley de Ohm.
- Lleve lentamente el electrodo a ~10 μm por encima de la retina. Aplique presión positiva al electrodo. Observe el cambio de reflexión cerca de la punta de la pipeta a medida que se acerca a la retina. Introduzca rápida pero suavemente la pipeta en el GCL y reduzca la presión positiva inmediatamente.
- Mueva la pipeta hacia una neurona marcada. Evite el contacto con otras neuronas, vasos sanguíneos y terminales de las células de Müller. Aplique más presión positiva si es necesario para evitar la obstrucción de los electrodos.
- Coloque la punta de la pipeta cerca de la línea media de una neurona marcada hasta que se vea un hoyuelo. Libere la presión positiva y permita que la membrana plasmática rebote en la punta de la pipeta.
- Aplique corrientes negativas de 20 a 120 pA a la pipeta para ayudar a la formación de un sello de giga-ohmios. Aplique una succión suave si es necesario para introducir la membrana plasmática en la pipeta. Espere 5 minutos después de la formación del sello para romper la membrana celular. Esto permite que la solución interna derramada se elimine por superfusión. Rompe la membrana mediante una succión suave.
- Después de la ruptura de la membrana y mientras está en el modo de pinza amperimétrica, active el equilibrio del puente y ajústelo con la perilla Raccess.
nota: Para una celda pequeña como la SAC, solo se necesita un ligero ajuste, si es que lo hay. Alternativamente, registre las corrientes postsinápticas excitadoras e inhibitorias en el modo de pinza de voltaje (VClamp) sosteniendo la celda a potenciales de inversión de cloruro (alrededor de -75 mV) y glutamato (alrededor de 0 mV), respectivamente. Compruebe y ajuste la posición de la pipeta si es necesario para acomodar la deriva ocasional de la retina y/o el micromanipulador.
- Para registrar el potencial de membrana o el cambio de corriente antes, durante y después del tratamiento farmacológico, prepare bloqueadores sinápticos (por ejemplo, cianquixalina [CNQX], (2R)-amino-5-fosfonopentanoato [AP5], picrotoxina, tubocurarina, etc.) y moduladores de canal (por ejemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenámico, etc.) frescos el día del experimento a partir de existencias congeladas. Diluya los medicamentos con la solución de Ringer carbogenada. Aplícalos de forma discontinua a través de la perfusión.
- Después de grabar, retire suavemente la pipeta del soma. Transfiera el conjunto de la cámara a un plato limpio. Separe y vuelva a unir la retina a otra membrana de nitrocelulosa aplanada sin agujeros perforados para garantizar la planitud de la retina durante la fijación.