Registros electrofisiológicos para la evaluación de las regeneraciones neuronales en cortes de médula espinal cocultivados

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

>1. Montaje de cortes de tejido de la médula espinal en MEAs

1. Calentar el medio nutritivo estéril en la incubadora (37 °C, tapa ligeramente desenroscada para la oxigenación).
2. Coloque la guía de electrodos múltiples o MEA con pinzas estériles con puntas cubiertas de goma a temperatura ambiente (RT) en la placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico con la guía de electrodos enfocada. Centre una gota de 6 μl de plasma de pollo en la guía de electrodos limpia, estéril y sin polvo. Con una espátula pequeña, deslice con cuidado dos secciones de la médula espinal con los lados ventrales enfrentados entre sí en la gota de plasma. No toque los electrodos con la espátula.
3. Agregue 8 μl de trombina alrededor de la gota de plasma de pollo. Con la punta de la pipeta de trombina, mezcle con cuidado y extienda la mezcla de plasma de pollo/trombina alrededor de las dos rebanadas. Nuevamente, no toque directamente la guía de electrodos frágil. Justo antes de la coagulación, aspire el exceso de plasma/trombina de pollo.
4. Tape la placa de Petri para que retenga la alta humedad mientras el conjunto MEA/cultivo permanece durante aproximadamente 1 hora en una cámara humidificada dentro de la incubadora a 37 °C.
5. Agregue con cuidado 10 μl de medio nutritivo a la cámara de cultivo, tape la placa de Petri y vuelva a colocarla en la incubadora durante unos 30 minutos.
6. Coloque cada conjunto de MEA/cultivo con puntas estériles cubiertas de goma en un tubo de rodillo, agregue 3 ml de medio nutritivo y cierre herméticamente la tapa. Coloque el tubo del rodillo en el tambor de rodillos, girando a 1 - 2 rpm en la incubadora en una atmósfera que contenga un 5% de CO₂ a 37 °C.
7. Cambie la mitad del medio nutritivo después de 7 días in vitro (DIV) y después 1 - 2 veces por semana.

>2. Lesiones mecánicas

1. Retire el conjunto MEA/cultivo con puntas estériles cubiertas de goma del tubo del rodillo y colóquelo en una placa de Petri sin medio nutritivo bajo un microscopio estereoscópico con el tejido enfocado. Verifique visualmente que las dos rebanadas estén fusionadas.
2. Sujete firmemente el conjunto MEA/cultivo colocando pinzas con puntas cubiertas de goma en el MEA.
3. Coloque una hoja de bisturí en la ranura del MEA cerca de las rodajas de tejido. Sostén el bisturí bastante horizontalmente.
4. Levante el mango del bisturí, pero deje que la hoja del bisturí permanezca en la ranura del MEA de tal manera que la hoja "ruede" desde la base hasta la punta y, por lo tanto, corte el tejido que cubre la ranura.
5. Cortar cualquier conexión de tejido residual con una punta de aguja de 25 G si es necesario. Trabaje solo en el área dentro de la ranura y no toque los bordes sensibles.
6. Vuelva a colocar el conjunto MEA/cultivo en el tubo del rodillo. Proporcione 3 ml de medio nutritivo fresco a los cultivos y colóquelos de nuevo en el tambor de rodillos de la incubadora.

>3. Registros electrofisiológicos de la actividad espontánea

1. Para investigar la regeneración funcional entre los dos cortes de la médula espinal después del número elegido de DIV, monte el conjunto MEA/cultivo en una cámara de registro en un microscopio y aplique aproximadamente 500 μl de solución extracelular (ver lista de materiales).
2. Espere 10 minutos antes de la primera grabación para permitir que el sistema se estabilice.
3. Registre la actividad espontánea básica 2x durante aproximadamente 10 minutos de cada electrodo de detección de actividad del MEA en RT.
4. Para garantizar condiciones extracelulares estables, intercambie la solución extracelular después de cada sesión de grabación.
5. Para desinhibir la red, aplique una solución extracelular que contenga estricnina (1 μM) y gabazina (10 μM) y espere al menos 2 minutos antes de iniciar la grabación.

4. Análisis de datos

NOTA: Para la detección de los potenciales de acción registrados extracelularmente, utilice un detector basado en desviaciones estándar y un discriminador posterior para cada electrodo.

1. Visualice la actividad neuronal detectada de cada electrodo en un gráfico ráster de acuerdo con los procedimientos estándar (Figura 1F).
2. Determine y muestre la actividad total de la red para cada segmento resumiendo el número de eventos en los canales apropiados dentro de una ventana deslizante de 10 mseg, desplazada en pasos de 1 mseg (Figura 1G).
3. Detecta en cada corte ráfagas individuales (grupos de actividad que aparecen en varios electrodos). Por lo tanto, establezca un umbral mínimo de actividad máxima en la actividad total de la red correspondiente y defina cada inicio y fin de ráfaga. Por ejemplo, un umbral adecuado es el 25% de la amplitud media de la ráfaga, y un inicio de ráfaga se puede definir como el primer evento en una ventana de tiempo de al menos 5 ms, y un final de ráfaga siendo el último evento en una ventana de tiempo de al menos 25 mseg.
4. Para cuantificar la regeneración funcional, calcule el porcentaje de ráfagas sincronizadas entre los dos segmentos. Para ello, calcule la latencia entre una ráfaga en un segmento y la siguiente ráfaga en el otro segmento.
   nota: Un par de ráfagas se denomina "sincronizado" cuando la latencia es menor que la longitud media de la ráfaga. Especialmente en co-culturas con mucha actividad, existe la posibilidad de que ambos lados inicien casualmente una ráfaga en la ventana de latencia elegida. Este hecho debe tenerse en cuenta en la cuantificación del porcentaje de ráfagas sincronizadas.

Figura 1. Visualización y análisis de la actividad espontánea. a) Diagrama de un MEA. Los electrodos recubiertos de platino se representan en negro, los cables transparentes en rojo y la ranura en el centro del MEA en amarillo. (B) Primer plano de la guía de electrodos ubicada en el centro de la MEA. (C) Imagen de campo claro de una cultura de 8 DIV de antigüedad. Las rodajas han crecido y se han fusionado a lo largo de los lados uno frente al otro. La barra amarilla representa la ranura libre de electrodos y aislamiento del MEA. Barra de escala = 400 μm (D) Cronología de los experimentos. Dos cortes de médula espinal de embriones de rata E14 se colocan uno al lado del otro en MEA. A los pocos días, las rodajas crecen y se fusionan a lo largo de los lados enfrentados entre sí. En un período de tiempo de 8 a 28 DIV, se realizan lesiones completas a través del sitio de fusión. Dos o tres semanas después, se registra la actividad espontánea y se fijan los cultivos para las tinciones inmunohistoquímicas. (E) Trazas de actividad espontánea de cada electrodo individual de un cultivo de 23 DIV de antigüedad. Para una visualización más clara, solo se ilustra uno de cada dos trazos. Los trazos naranjas representan la actividad que se ha registrado en el sector del lado derecho y los trazos azules del lado izquierdo. La mayoría de las ráfagas se sincronizan entre los dos. La flecha señala una ráfaga que se produce en el sector izquierdo y que solo se propagó parcialmente al sector derecho. Sin embargo, la actividad en el segmento derecho no alcanzó el umbral elegido de al menos el 25% de la actividad máxima máxima promediada del lado correspondiente y, por lo tanto, no se detecta como una ráfaga. Los aumentos de la derecha representan el último par de ráfagas sincronizadas. (F) En (E) se muestra un gráfico ráster de la actividad. (G) Gráfico de actividad de red con ráfagas definidas (barras por debajo de la línea de base) de la actividad que se muestra en (E).