Excitación externa de cultivos neuronales con patrones unidimensionales

En este artículo

Resumen

Fuente:Stern, S., et al. Excitación externa de neuronas utilizando campos eléctricos y magnéticos en cultivos unidimensionales y bidimensionales. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra una técnica para estimular cultivos neuronales con patrones de líneas con un campo eléctrico uniforme y unidireccional.

Protocolo

>1. Imágenes de actividad espontánea o evocada en cultivos neuronales con colorantes fluorescentes.

Prepare una solución de 50 μg de colorante fluorescente sensible al calcio (consulte la Tabla de materiales/reactivos) en 50 μL de DMSO (dimetilsulfóxido).
Prepare una solución de registro extracelular (EM) que contenga (en mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glucosa, 45 sacarosa (pH 7,4).
Incubar el cultivo neuronal en 2 mL EM con 8 μL de la solución de colorante fluorescente sensible al calcio durante 1 h. Proteger de la luz y girar suavemente para asegurar una distribución homogénea del colorante a las células.
Reemplace la solución con EM nueva antes de la toma de imágenes. Las imágenes fluorescentes se muestran en la Figura 1.
Imagen en un microscopio de fluorescencia con filtros ópticos para la obtención de imágenes de fluorescencia de calcio (pico de excitación a 488 nm, pico de emisión a 520 nm), utilizando una cámara y un software capaz de cuantificar la intensidad de cualquier región de interés (ROI) dentro del campo de visión del microscopio.

>2. Estimulación eléctrica de cultivos

NOTA: La configuración básica para la estimulación eléctrica se muestra en la Figura 2. Un cubreobjetos en el que se ha cultivado el cultivo neuronal durante unos 14 días se coloca en una placa de Petri bajo un microscopio de fluorescencia. La actividad eléctrica de las neuronas se visualiza utilizando tintes sensibles al calcio mientras se aplica un voltaje a través de dos pares de electrodos de baño que se colocan fuera del cultivo. Los electrodos son accionados por un generador de señales cuya salida es amplificada por un amplificador de doble canal. Se prefiere el control de voltaje para la estimulación sobre el control de corriente más estándar, ya que los vectores del campo eléctrico se determinan directamente, lo que permite una adición y combinación de vectores sencilla. Esto requiere una verificación cuidadosa de la uniformidad del campo eléctrico, que se puede realizar en toda la muestra para el caso del control de voltaje. Al utilizar el control de voltaje, se debe tener cuidado de evitar cualquier bucle de tierra y se debe verificar la homogeneidad del campo eléctrico.

Para la estimulación eléctrica con un campo eléctrico homogéneo, utilice un par de cables de electrodos paralelos.
1. Utilice electrodos hechos de platino con un grosor del orden de 0,005'' (127 μm). Cuando se utilice con los cubreobjetos de 13 mm, asegúrese de que la distancia entre los dos electrodos sea de unos 11 mm y coloque los electrodos 1 mm por encima del cultivo.
  NOTA: Para fabricar el portaelectrodos (Figuras 3A), utilice politetrafluoroetileno (PTFE). Taladre agujeros estrechos a través del PTFE para insertar los electrodos. El dispositivo debe estar más alto que la solución extracelular para que el extremo superior, donde están expuestos los electrodos, nunca entre en contacto con la solución. Para el aislamiento, use pegamento epoxi en cualquier parte de los cables del electrodo que pueda estar expuesta.
2. Utilice una forma de pulso cuadrado con un ciclo de trabajo del 50%, sin componentes de CC para evitar la electrólisis. Varíe la duración del pulso entre 10 μs y 4 ms para causar una estimulación efectiva sin quemar el cultivo. Asegúrese de que la amplitud esté en el orden de ± 22 V (consulte la figura 3). El pulso cuadrado se puede observar en un osciloscopio conectado en paralelo a los electrodos.
  nota: Para una fácil programación de cualquier forma de onda deseada, utilice un software comercial de edición de formas de onda (consulte la lista de materiales). Introduzca gráficamente la forma de onda deseada y envíela al generador de formas de onda.
Para probar la homogeneidad del campo, use un electrodo de sonda. Utilice una rejilla de al menos 1 mm x 1 mm para permitir que la sonda se mueva en el área entre los electrodos y mida el potencial eléctrico.
1. Mide el potencial eléctrico. Utilice para calcular el campo eléctrico. Utilice uno de los electrodos como electrodo de referencia. Mida el campo eléctrico con duraciones de pulso variables entre 100 μs y 4 ms (consulte la Figura 3B para ver un ejemplo de duración de pulso de 100 μs) para verificar que el campo sea homogéneo dentro del rango de duraciones de estimulación><. nota: Consulte la Figura 3D para ver un ejemplo de una homogeneidad de campo eléctrico medida cuando la duración del pulso era de 1 ms.

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Resultados

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Figura 1: Ejemplo de trazas de transitorios de calcio fotografiadas durante ráfagas de red sincrónicas. Una imagen de neuronas que fueron teñidas antes del experimento con un tinte de calcio. B. Trazas de intensidad frente al tiempo de los ROI en A, con el color de la traza representando el color del borde del ROI en A. Un gran aumento en la intensidad sincronizada dentro de los tres...