Estimulación de cultivos neuronales modelados por un campo magnético

Resumen

Fuente: Stern, S., et al., Excitación externa de neuronas utilizando campos eléctricos y magnéticos en cultivos unidimensionales y bidimensionales. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra un método para estimular cultivos neuronales cultivados en un anillo circular con patrón en un cubreobjetos, utilizando un campo magnético variable en el tiempo.

Protocolo

1. Preparación de cubreobjetos para cultivos 1D.

1. Limpie los cubreobjetos de vidrio por inmersión en una solución base de piraña que consta de 75 mL de DDW, 25 mL de solución de amoníaco al 25% y 25 mL de peróxido de hidrógeno al 30%. Coloque la solución con los cubreobjetos de vidrio en una placa calefactora a ~ 50 °C durante 30 minutos y luego seque los cubreobjetos de vidrio con nitrógeno.
2. En primer lugar, los cubreobjetos se recubren con una fina película de cromo (99,999%) de 6 Å de espesor, seguida de una capa de oro de 30 Å (99,999%), utilizando deposición de vapor o pulverización catódica.
   1. Para lograr una tasa de pulverización catódica de 0,05 a 1 Å /s, utilice una máquina de pulverización catódica con 2 haces tipo E y un sistema de vacío de 260 l/s con tamaños objetivo de 2" y 4". Utilice una etapa de rotación que pueda ir de 0 a 100 rondas por minuto (RPM). Utilice una potencia de pulverización catódica de corriente continua (CC) de 0 a 750 vatios.
   2. Para obtener plasma a una presión de 10 mTorr en la cámara, gire el dispositivo a 30 rpm y use argón al 99.999%.
   3. Opere la fuente de alimentación de las pistolas de pulverización catódica a una potencia de pulverización catódica de CC de 40 W para el cromo, lo que conduce a una tasa de cobertura de ~ 0,12 Å / s, y a una potencia de pulverización catódica de CC de 10 W para el oro, lo que lleva a ~ 0,28 Å / s.
3. Usando ultrasonido durante 30 min, disuelva 0,1 g de 1-octadecanetiol en 100 mL DE ETANOL ABS AR. Coloque los cubreobjetos recubiertos de Cr-Au en esta solución durante 2 h, luego lávelos con etanol ABS AR y séquelos con nitrógeno.
4. Prepare una solución de 100 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) y 3,5 g de un copolímero tribloque (ver Tabla de Materiales/Reactivos) agitando durante 1 - 2 h a 600 - 700 rpm. Coloque los cubreobjetos en la solución durante 1 h. Seque los cubreobjetos con nitrógeno.
5. Grabe mecánicamente el patrón deseado rascando la capa de biorrechazo. Haga esto usando un trazador de bolígrafos, donde el bolígrafo se reemplaza por una aguja de grabado. Raspa el patrón a través de las capas de metal para llegar al vidrio subyacente. Controle este proceso mediante una computadora para lograr un patrón deseado replicado. Los patrones formados por este proceso se muestran en la Figura 1 y la Figura 2.
6. Prepare una capa biocompatible de 100 mL DE D-PBS, 3,5 g de copolímero tribloque, 35,7 μL/mL de fibronectina y 29 μl/mL de laminina.
   1. Esterilice los cubreobjetos con luz ultravioleta durante al menos 10 minutos. Incube los cubreobjetos en la solución biocompatible preparada durante la noche.
      NOTA: La capa biocompatible se formará solo donde la capa de biorrechazo se haya grabado en el paso anterior.
   2. Al día siguiente, lave los cubreobjetos dos veces con P-DBS. Incubarlos en PM durante la noche. Los cubreobjetos ya están listos para el recubrimiento de celdas.

>2. Mantenimiento de los cultivos neuronales.

1. Prepare el medio de cambio (CM) compuesto por (por mL): 0,9 mL MEM+3G, 0,1 mL HI HS, 10 μL de 5-fluoro-2′-desoxiuridina (FUDR) con uridina 100x.
2. Prepare el medio final (FM) compuesto por (por mL): 0.9 mL MEM+3G y 0.1 mL HI HS.
3. Reemplace PM con 1-1.5 mL CM después de 4 días in vitro (DIV). A las 6 DIV, reemplace el 50% del CM con CM nuevo. En DIV 8, cambie el medio a 1,5 mL de FM, seguido de un cambio del 50% de FM cada 2 días. Después de aproximadamente una semana, surge una actividad sincrónica espontánea.

>3. Imágenes de actividad espontánea o evocada en cultivos neuronales con colorantes fluorescentes.

1. Prepare una solución de 50 μg de colorante fluorescente sensible al calcio (consulte la Tabla de materiales/reactivos) en 50 μL de DMSO (dimetilsulfóxido).
2. Prepare una solución de registro extracelular (EM) que contenga (en mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glucosa, 45 sacarosa (pH 7,4).
3. Incubar el cultivo neuronal en 2 mL EM con 8 μL de la solución de colorante fluorescente sensible al calcio durante 1 h. Proteger de la luz y girar suavemente para asegurar una distribución homogénea del colorante a las células.
4. Reemplace la solución con EM nueva antes de la toma de imágenes. Las imágenes fluorescentes se muestran en la Figura 3.
5. Imagen en un microscopio de fluorescencia con filtros ópticos para la obtención de imágenes de fluorescencia de calcio (pico de excitación a 488 nm, pico de emisión a 520 nm), utilizando una cámara y un software capaz de cuantificar la intensidad de cualquier región de interés (ROI) dentro del campo de visión del microscopio.

>4. Estimulación magnética de cultivos

>Nota: La configuración básica para la estimulación magnética se muestra en la Figura 1. En la parte superior derecha se muestra un microscopio de fluorescencia invertida que se utiliza para obtener imágenes de colorantes sensibles al calcio en las neuronas. La bobina magnética (círculos azules) se coloca unos 5 mm concéntricamente por encima de un cultivo de anillo neuronal (contorno azul). Una bobina de captación (círculo rojo) en la circunferencia de la placa de Petri monitorea el voltaje inducido por el pulso magnético. En la parte superior izquierda se muestra la dinámica medida de la bobina del estimulador magnético (MS) con una carga de voltaje del condensador de 5.000 kV, integrada desde la bobina de captación. El campo eléctrico inducido (calculado para un radio de anillo de 14 mm) se representa en verde, mientras que el campo magnético se representa en azul. En la parte inferior se muestran imágenes del cultivo neuronal. En la parte inferior izquierda hay una imagen de campo claro de un cubreobjetos estampado de 24 mm. Las áreas blancas son las neuronas. El patrón fotografiado consiste en cultivos de anillos concéntricos con diferentes radios. En la parte inferior derecha hay un zoom en un segmento corto de los anillos, que muestra neuronas individuales. Para una escala, el ancho de los anillos es de aproximadamente 200 μm.

1. Haga crecer las neuronas en un patrón de anillo circular (grabado como se describe en 1.5) para la estimulación de cultivo 1D. Utilice un colorante fluorescente sensible al calcio para obtener imágenes de calcio (como se describe en la sección 3) con un cultivo 1D modelado en líneas delgadas (170 μm) y largas (10 mm).
   1. Utilice una bobina magnética circular y coloque una placa de Petri aproximadamente 5 mm por debajo y concéntrica con la bobina. Utilice una bobina personalizada de aproximadamente 30 mm (diámetro interior, diámetro exterior de 46 mm) con una inductancia de L = 90 mH impulsada por un MS casero o comercial cargado con un voltaje máximo de 5 kV.
   2. Para estimular magnéticamente los cultivos neuronales, un alto voltaje y corriente se descargan a través de una bobina conductora utilizando un interruptor de alta corriente-alto voltaje. El estimulador magnético (MS) se puede construir utilizando condensadores grandes, del orden de 100 mF, para obtener un alto voltaje de 1 a 5 kV. Alternativamente, utilice un MS disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales/Reactivos).
      nota: Utilice un alambre de cobre rectangular recubierto de poliéster de 0,254 mm de grosor y 6,35 mm de ancho para fabricar una bobina casera. Gire los cables en marcos hechos a medida, aislados con fibras de vidrio y fundidos en epoxi (consulte la tabla de materiales/reactivos). Alternativamente, utilice bobinas disponibles comercialmente (consulte la Tabla de Materiales/Reactivos).

Resultados

Figura 1: Esquema de la configuración utilizada para la estimulación magnética de cultivos neuronales. En la parte superior se muestra la bobina magnética (círculos azules), que se encuentra a 5 mm concéntricamente por encima del cultivo del anillo neuronal, colocada en una placa de Petri (contorno azul). Una bobina de captación (círculo rojo) colocada en la circunferencia de la placa de Petri mide e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Solución de grabación extracelular
D-(+)-Glucosa, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Medio de recubrimiento, solución de registro extracelular
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cultivos celulares
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F1141	Recubrimiento biológico
Fluo4, AM	Tecnologías para la vida	F14201	Imágenes de actividad espontánea o evocada
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Cambiar de medio
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272	Medio de enchapado, Medio de cambio, Medio final.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Solución de grabación extracelular
HOLA HS	bi	04-124-1A	Medio de recubrimiento, Medio de cambio, Medio final
KCl, 3M	Merck	1049361000	Solución de grabación extracelular
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Recubrimiento.
MEM x 1	Gibco	21090-022	Medio de recubrimiento, Medio de cambio, Medio final
Cloruro de magnesio , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Solución de grabación extracelular
NaCl, 4M	Bio-Laboratorio	19030591	Solución de grabación extracelular
Octadecanetiol	Sigma-Aldrich	Año 1858	Limpieza de cubreobjetos recubiertos de Cr-Au (cultivos 1D)
Sacarosa, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Solución de grabación extracelular
uridina	Sigma-Aldrich	U3750	Cambiar de medio
Máquina de pulverización catódica	AJA International, Inc	Serie ATC Orion-5	Recubrimiento de vidrio con finas capas de metal
Trazador de bolígrafos	Hewlett Packard	HP 7475A	Grabado del patrón en el cubreobjetos recubierto
fuente de alimentación	matriz	MPS-3005 LK-3	Fuente de alimentación a la máquina de pulverización catódica
Epoxi	Cognis	Versamid 140	Fundición de bobinas caseras
Epoxi	cáscara	EPÓN 815	Fundición de bobinas caseras