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Medición de la fisiología sináptica en vivo con matrices de electrodos múltiples (MEAs)
>1. Prepare MEAs para el cultivo celular.
- Limpie la superficie de cada MEA con 1 mL de detergente durante 1 h. Enjuague con agua desionizada (DI) estéril, enjuague con etanol al 70% para esterilizar y luego seque al aire en una cabina de bioseguridad bajo luz ultravioleta.
nota: Los MEA pueden almacenarse en agua desionizada a 4 °C en condiciones estériles hasta su uso.
- Prepare una solución de 0,5 mg/ml de poliornitina (PLO) disolviendo 50 mg de PLO en 100 ml de tampón de ácido bórico. Cubrir la superficie de cada MEA con 1 mL de PLO para hacerla hidrófila e incubar a 37 °C durante un mínimo de 4 h. Retire el PLO y lave la superficie con agua desionizada.
- Diluir la solución de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) con medios basales (DMEM/F12) para preparar una solución madre de 1 mg/mL. Para una solución de trabajo, vuelva a suspender 3 mL de stock de ECM en 33 mL de medio DMEM/F12 preenfriado, llevando el volumen total a 36 mL para una concentración de 80 μg/mL.
- Añadir 1 mL de solución de trabajo ECM a cada MEA e incubar a 37 °C durante un mínimo de 4 h.
- Retire el ECM y coloque las esferas en 1,5 mL de medio sobre una superficie MEA, asegurándose de que las esferas estén colocadas encima de la guía de electrodos (Figuras 1A, 1A'). Deje que los medios se adhieran durante 2 días. Cambie la mitad del medio cada 2-3 días (o con más frecuencia si es necesario), asegurándose de que las esferas no se alteren.
nota: La adición de factores de crecimiento puede mejorar la supervivencia y maduración del cultivo.
>2. Mide la actividad eléctrica de las esferas neuronales.
- Configure un sistema de matriz de electrodos múltiples (MEA) con una cabecera con temperatura controlada. Cree un programa de software con un filtro de paso alto de 5 Hz, un filtro de paso bajo de 200 Hz y un umbral de pico de 5 veces la desviación estándar (SD).
- Coloque el MEA en el escenario de la cabeza y registre la actividad eléctrica espontánea (Figura 1B, B'). Guarde los datos sin procesar, incluida la frecuencia y la amplitud de los picos, para el análisis estadístico.
nota: Se puede utilizar un sistema de perfusión con el MEA para agregar agentes farmacológicos o para aumentar el flujo de medios frescos para el registro a largo plazo. Según se desee, se puede realizar un procesamiento posterior adicional de los picos.
