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1. Ablación de una subpoblación de neuronas usando un microscopio láser de dos fotones
NOTA: Si los usuarios planean realizar imágenes de Ca después de la ablación, utilicen la línea UAShspzGCaMP6s. Si los usuarios planean realizar un registro del comportamiento después de la ablación, utilice la línea UAS:EGFP, ya que la ablación de las células positivas para EGFP es más fácil de realizar que la de las células que expresan GCaMP6s.
- Comience por configurar el acoplamiento de una línea Gal4 que etiquete neuronas específicas que se van a estudiar y UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Asegúrese de usar el fondo de nácar para ambos padres para que se puedan obtener homocigotos de nácar.
nota: Los homocigotos del nácar no contienen melanóforos en la superficie del cuerpo (Figura 1B). En el presente estudio, se utiliza una línea Gal4 gSAIzGFFM119B (que marca el pretectum) y otra línea Gal4 hspGFFDMC76A (que marca el ILH).
- Al día siguiente de la preparación del apareamiento, recoja los huevos de pez cebra y levántelos a la etapa larvaria, momento en el que las neuronas de interés emitirán reporteros fluorescentes.
- Monte la larva de pez cebra en un 2% de agarosa de bajo punto de fusión (Figura 1B).
- Comience preparando una solución madre de agarosa al 2%: Disuelva 2 g de polvo de agarosa de bajo punto de fusión en agua del sistema de 100 ml (es decir, el agua utilizada para mantener el pez cebra adulto en un sistema de agua circulante) o agua E3 calentando el agua hasta el punto de ebullición en un microondas y mezclando vigorosamente.
- Calienta en el microondas el caldo de agarosa de bajo punto de fusión al 2% hasta que hierva. Vierta 3,5-4,0 mL de agarosa en la tapa de una placa de Petri de 6 cm. Espere hasta que la agarosa se enfríe para que esté tibia al tacto antes de continuar.
- A continuación, coloque una sola larva (no anestesiada en este paso) en la agarosa. Siga ajustando la posición y orientación de la larva para que quede erguida, utilizando una aguja de disección (Figura 1C), hasta que la agarosa se solidifique para asegurar el posicionamiento adecuado de la larva.
nota: La larva continuará nadando mientras la agarosa se solidifica.
- Una vez que la larva esté posicionada, espere 5 minutos para que la agarosa se solidifique por completo.
- Vierta 5 mL de solución de tricaína (0,4% a 1x concentración de trabajo) sobre la agarosa.
nota: Para evitar los movimientos de las larvas durante la ablación con láser, las larvas deben mantenerse anestesiadas durante todo el procedimiento de ablación.
- Ablaciona la larva utilizando la función de blanqueo en un sistema de microscopía láser de dos fotones.
- Coloque la larva incrustada en agarosa bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones y ponga en marcha el sistema de microscopía.
- Inicie el software de adquisición de imágenes y haga clic en el botón "Encendido" en la pestaña "Láser" para encender el láser (Figura 1D). Espere a que el "Estado" del láser cambie de "Ocupado" a "Modo bloqueado".
- En la pestaña "Canales", ajuste la longitud de onda del láser a 880 nm (potencia máxima: aproximadamente 2.300 mW) para la ablación con EGFP, o a 800 nm (potencia máxima: aproximadamente 2.600 mW) para la ablación con GCaMP.
- Seleccione la lente del objetivo 20X moviendo manualmente el revólver de la lente. Haga clic en la pestaña "Localizar", haga clic en "GFP" para cambiar las vías ópticas y vea directamente la fluorescencia a ojo.
- Localiza el cerebro de la larva de pez cebra en el centro de la vista; luego haz clic en la pestaña "Adquisición" para volver a la microscopía de dos fotones.
- Como registro de la condición "antes de la ablación", tome una imagen de pila z con la lente del objetivo 20X a una velocidad de escaneo rápida (para evitar daños por calor). Posteriormente se comparan las imágenes tomadas antes y después de los experimentos de ablación (Figura 2A). Para obtener una pila z, haga clic en "Pila Z" para seleccionar la opción pila z y expandir la pestaña. Establezca el límite inferior (haga clic en el botón "Establecer primero") después de enfocarse en el extremo ventral del cerebro de la larva, y establezca el límite superior (haga clic en el botón "Establecer último") después de enfocarse en la superficie más dorsal del cerebro. A continuación, haga clic en el botón "Iniciar experimento" para ejecutar la adquisición de imágenes de la pila z.
- Seleccione la lente del objetivo 63X moviendo manualmente el revólver de la lente.
- Haga clic en la pestaña "Localizar" para cambiar a la microscopía epifluorescente, ubique las células que se van a ablacionar en el centro de la vista a simple vista, luego haga clic en la pestaña "Adquisición" para volver a la microscopía de escaneo láser.
- En la pestaña "Modo de adquisición", establezca el "Tamaño de fotograma" en 256 x 256. Haga clic en "En vivo" y observe las neuronas de interés.
- Comenzando desde el lado más dorsal, encuentre un plano focal en el que las células que se van a ablacionar estén enfocadas.
- Marque un área pequeña y circular de aproximadamente un tercio del tamaño de la célula en diámetro en cada neurona como una región de interés (ROI) utilizando la función "Regiones".
- Establezca la velocidad de escaneo en 13,93 s/256 x 256 píxeles (134,42 μm x 134,42 μm), lo que corresponde a un tiempo de permanencia del láser de aproximadamente 200 μs/píxel o 200 μs/0,5 μm. Además, establezca 4 repeticiones ('Ciclo de iteración: 4'). Como alternativa, optimice el número de iteraciones y la velocidad de escaneo para lograr una ablación suficiente.
- Realice la función 'Blanqueo' para la ablación, en combinación con la 'Serie temporal (2 ciclos)' para obtener imágenes de la muestra (antes y después de la ablación) y 'Regiones' (para establecer los ROI) o funciones equivalentes en el software utilizado (Figura 1D).
- Al comparar la primera imagen (antes de la ablación) y la segunda imagen (después de la ablación) en el ciclo de la serie temporal, asegúrese de que después del blanqueo, la fluorescencia en las células objetivo disminuya a la observada en el nivel de fondo (Figura 2B).
- Si la fluorescencia sigue presente después de la ablación, aumente el número de iteraciones.
- A continuación, mueva el plano focal un poco más profundo (es decir, hacia el lado ventral) y elija el siguiente plano focal donde aparezcan las células no ablacionadas.
- Realice la función de blanqueo como se describe anteriormente (paso 1.9). Repita estos pasos hasta que se hayan ablacionado todas las células de la estructura neuronal de interés.
- Después de pasar por todos los planos focales que cubren las estructuras neuronales que se van a ablacionar, verifique que las células tengan fluorescencia abolida. Si se encuentra que algunas células todavía son fluorescentes debido a una ablación insuficiente, vuelva a irradiarlas con láser como se describió anteriormente.
- Si es necesario recuperar la larva de la agarosa después de la irradiación con láser, no intente sacarla a la fuerza de la agarosa porque esto podría dañar a la larva. En su lugar, haga con cuidado pequeños cortes en la agarosa alrededor de la larva perpendicularmente a la superficie de su cuerpo. Luego, espere a que la larva salga nadando de la agarosa por sí sola cuando desaparezca el efecto del anestésico.
- Proceda a la siguiente larva para la ablación o realice experimentos de control utilizando otra población de neuronas que no estén involucradas en el comportamiento bajo investigación.
nota: Aquí, como control, las neuronas del bulbo olfativo en UAS:EGFP; Las larvas de gSAIzGFFM119B se ablacionaron con láser utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente (Figura 2A, derecha).
- Espere varias horas o 1 día para la recuperación antes de proceder a la toma de imágenes de Ca (Sección 2) o al registro del comportamiento (Sección 3). Durante este tiempo de recuperación, verifique la salud de la larva (es decir, natación espontánea normal, sin daño aparente por calor alrededor del área ablacionada, etc.) y retire las larvas que muestren cualquier signo de mala salud.
>2. Imágenes de calcio para registrar la actividad neuronal evocada por presas en las larvas de pez cebra ablacionadas con Pretectum
- Para preparar una cámara de registro, coloque una junta de cámara de hibridación de sello seguro en un portaobjetos de vidrio, con el lado adhesivo hacia el vidrio, y retire el sello superior.
nota: Esto crea una pequeña cámara de registro de 9 mm de diámetro y 0,8 mm de profundidad (Figura 3A).
- A continuación, coloque una malla de nailon (tamaño de la abertura: 32 μm) en un tubo de 50 ml que tenga el corte inferior abierto. Use la tapa para sujetar la malla en el tubo (Figura 3B).
- Prepare los paramecios (que es la presa que se utilizará como estímulo visual para la larva).
nota: Prepare previamente el cultivo de Paramecium (pasos 2.3.1 y 2.3.2).
- Obtenga el cultivo de semillas de paramecia de fuentes comerciales o centros académicos de recursos biológicos con anticipación.
- Cultive el paramecio durante varios días en agua que contenga paja de arroz esterilizada en autoclave y un pellet de levadura de cerveza seca (Figura 3C).
- Vierta el cultivo de paramecio a través de 2 tamices sucesivamente (uno con una apertura de 150 μm, seguido de otro con una apertura de 75 μm) para eliminar los residuos del cultivo.
- Recoja la parameca en el flujo del paso anterior en una malla de nailon (apertura de 13 μm).
- Vuelva a suspender la parameca de la malla de nailon en un vaso de precipitados de vidrio con una botella exprimible de agua del sistema (Figura 3D).
- Enjuague la malla (Figura 3B) en agua del sistema 2 veces (Figura 3E).
nota: El propósito de este paso es eliminar cualquier posible odorante y saborizante contenido en el medio de cultivo de paramecio, ya que el objetivo del presente estudio es observar la actividad neuronal impulsada visualmente.
- Coloque una larva de pez cebra en la solución de tricaína para anestesiar.
- Monte una sola larva en agarosa de bajo punto de fusión al 2%.
- Primero, cocine en el microondas un 2% de agarosa de bajo punto de fusión y agregue 1/10 de volumen de tricaína concentrada 10x a la agarosa.
- Coloque una gota de agarosa que contiene tricaína en la cámara de registro (Figura 3A).
- Después de confirmar que la agarosa no está demasiado caliente, coloque la larva anestesiada (a partir del paso 2.5) en la agarosa, eliminando inmediatamente cualquier exceso de agarosa para que la superficie de la agarosa se vea ligeramente convexa.
- Oriente rápidamente la larva a una posición vertical con una aguja de disección (Figura 1C).
nota: Estos procedimientos deben completarse dentro de varios segundos antes de que la agarosa se solidifique.
- Una vez que la larva esté colocada correctamente, espere 5 minutos para que la agarosa se solidifique por completo. A continuación, vierta una gota de 1x solución de tricaína sobre la agarosa.
- Retire la agarosa alrededor de la cabeza de la larva de pez cebra y deje espacio para que el paramecio nade con un cuchillo quirúrgico. Para hacer esto, primero, haga algunos cortes pequeños en la agarosa (Figura 3F). Luego, retire con cuidado el exceso de agarosa vertiendo suavemente el agua del sistema en la cámara.
nota: En este paso, la tricaña se lavará.
- A continuación, coloque un paramecio en la cámara de grabación para que sirva como estímulo visual.
nota: Cuando el paramecio nada cerca de la cabeza de la larva de pez cebra, evocará una respuesta neuronal (Figura 3G).
- Coloque la cámara de registro bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara CMOS científica (Figura 3H) y seleccione una lente de objetivo de 2,5X (Figura 3I).
- Recopile grabaciones de lapso de tiempo de las señales de fluorescencia GCaMP.
- Inicie la aplicación de adquisición de imágenes para la cámara equipada.
- Haga clic en "Panel de secuencia" y seleccione "Registro de disco duro" en el panel. En la sección Configuración de escaneo, establezca el "Recuento de fotogramas" en 900 o cualquier otro número total de fotogramas que desee.
nota: Si está disponible, utilice un software de grabación de lapso de tiempo con un módulo (en este caso, "Grabación en disco duro") que permita guardar eficazmente los datos en un disco duro.
- En el panel "Captura", establezca el tiempo de exposición en 30 ms (es decir, 33,3 fps) y Agrupación 2 x 2.
- En el panel táctil de control del microscopio, elija un conjunto de filtros para GFP, ya que el GCaMP tiene espectros de excitación/emisión similares a los de GFP.
- Haga clic en "En vivo" en el panel de captura para ubicar la larva en la vista y el enfoque de la cámara (Figura 4A), y luego haga clic en "Detener en vivo" y haga clic en el botón "Inicio". Guarde la película en .cxd o cualquier otro formato que contenga información sobre la condición de adquisición.
