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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Electrofisiología
NOTA: El objetivo de este protocolo es obtener registros de pinza de corriente de célula completa de neuronas piramidales de capa II/III identificadas visualmente por la expresión de GFP en cerebros de ratón electroporados con GFP (o cualquier otra proteína fluorescente previamente electroporada). Con este protocolo es posible estudiar el efecto de una modificación genética introducida por el IUE sobre las propiedades eléctricas de la neurona. La adquisición de modos de disparo específicos es un proceso gradual de diferenciación que implica la expresión dinámica de un amplio repertorio de canales iónicos y que da lugar a la expresión de modos de disparo transitorios antes de las etapas postnatales tardías. Por ejemplo, no se observan respuestas eléctricas maduras en las capas II/III de la corteza somatosensorial del ratón antes de P16.
- Requisitos previos para los cortes agudos
- Prepare 1 L de ACSF utilizando agua de alta pureza (doble destilada) que contenga 119 mM de NaCl, 26 mM de NaHCO3, 11 mM de glucosa, 2,5 mM de KCl, 1,2 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2 y 1 mM de NaH2PO4. Ajuste el pH a 7,3 - 7,4 con HCl o NaOH. Ajuste la osmolaridad a 290 mOsm.
- Burbujee ACSF con carbógeno (95% O2/5% CO2) durante 15 - 20 min usando tubos de teflón (~ 1 mm), para estabilizar el pH a 7,3 - 7,4.
- Requisitos previos para la grabación de célula completa
- Asegúrese de que la estación de electrofisiología esté equipada con una cámara de registro, un sistema de perfusión, un microscopio, electrodos (de registro, estimulantes y de tierra), macro y micromanipuladores, una mesa rígida resistente a las vibraciones y una jaula de Faraday, un estimulador, un amplificador y un convertidor de analógico a digital (A/D), una computadora con software de adquisición y un filtro GFP (o cualquier otro fluorocromo) para analizar neuronas modificadas genéticamente (Figura 1A).
- Prepare la solución intracelular, que contiene 115 mM de gluconato de potasio, 2 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 20 mM de KCl, 4 mM de Na2ATP y 0,3 mM de Na3GTP, ajustada a pH 7,2 por KOH y a 290 mOsm por KCl.
- Fabrica pipetas de parche tirando de capilares de vidrio de borosilicato. Prepare los electrodos de parche con un extractor de micropipetas. Utilice capilares de borosilicato (1,5 mm de diámetro exterior, 0,86 mm de diámetro interior, 10 cm de longitud). Haga que los electrodos de parche muestren resistencias de 3-10 MΩ cuando estén llenos de solución intracelular.
- Perfundir la cámara de registro con ACSF a una velocidad de 2 mL/min. Mantener la temperatura de la cámara a aproximadamente 33 °C.
- Grabación de celda completa
- Transfiera las rodajas a la cámara de registro con una pipeta Pasteur (corte la punta larga) o un cepillo pequeño. Sostenga la rebanada con un arpa. Perfundir las lonchas constantemente con ACSF a una velocidad de 2 mL/min.
- Parche una neurona GFP positiva.
- Coloque el corte en la cámara de registro y encuentre el área de interés a través del microscopio con un aumento bajo (10X). A continuación, busca una celda GFP positiva para parchear con el objetivo 60x.
- Llene el electrodo de registro con solución intracelular. Utilice la jeringa conectada al filtro (filtro de 4 mm) y la punta del microcargador para llenar el electrodo de registro con solución intracelular.
- Coloque la pipeta de vidrio en el soporte para pipetas. Coloque la punta de la pipeta en la bañera y concéntrese en la punta. Una vez que la pipeta esté en el baño, aplique presión positiva a través del sistema de control de contrapresión.
- Parchear una neurona que es fluorescente (Figura 1B).
- Acérquese a la célula de interés bajo guía visual mientras mantiene la contrapresión en la pipeta. Ante la aparición de un pequeño hoyuelo en la superficie de la celda, libere la presión. En este punto, se puede formar un sello hermético (resistencia superior a 1 GΩ). De lo contrario, aplique una ligera presión negativa (succión) para facilitarlo.
- Mientras se forma el sello, lleve la pinza de voltaje de retención a -60 mV. Una vez que se haya formado el sello GΩ, aplique un pulso de succión para romper la membrana celular debajo de la pipeta y entrar en modo de celda completa.
- Registre la actividad utilizando las condiciones de pinza amperimétrica. Una vez en el modo de celda completa, cambie del modo de pinza de voltaje al modo de pinza de corriente y comience a grabar. Por ejemplo, para registrar la excitabilidad de la célula, aplique inyecciones de corriente despolarizante de 500 ms de duración (100 - 400 pA).
- Calcule las velocidades de disparo trazando el número de potenciales de acción a lo largo del tren para aumentar las corrientes de entrada.
nota: El potencial de membrana en reposo, la resistencia de entrada y la capacitancia de la membrana también se pueden calcular a partir de las grabaciones.
