Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Lechones y manejo de lechones
- Utilice lechones machos y hembras de manera sistemática y aleatoria para eliminar cualquier posible confusión basada en el sexo de acuerdo con las pautas de ARRIVE.
NOTA: Dado que el período de máximo crecimiento cerebral es dentro de los 3-5 días posteriores al nacimiento de los lechones, la experimentación se realiza únicamente con lechones de 3-5 días de edad.
- Asegúrese de que los lechones lleguen al vivero al menos 24 horas antes de la experimentación para permitir la aclimatación al medio ambiente><.
nota: El personal veterinario capacitado brinda atención de rutina a los animales. Los lechones se mantienen en jaulas individualmente controladas y monitoreadas continuamente y reciben un sustituto de leche nutricionalmente completo ad libitum para prevenir la hipoglucemia. Los lechones también se mantienen sin reposición de leche (nil per os), durante al menos 3 h antes de la anestesia y se les suministran mantas y juguetes para garantizar niveles normales de estimulación. Si es posible, mantenga varios lechones en la misma jaula para permitir la socialización.
>2. Desarrollo y personalización de matrices de microelectrodos (MEAs) para estudios de neurotoxicidad inducida por anestesia (AIN) en un modelo de lechones
NOTA: Esta tecnología utiliza MEAs basados en enzimas que están pre-recubiertos con enzima y galvanizados con clorhidrato de m-fenilendiamina (mPD). Los electrodos se diseñaron a medida con un eje rígido de 40 mm y se fabricaron para su uso en lechones (Figura 1).
- Consulte la descripción detallada de la preparación y calibración de MEA (Figura 2).
>3. Anestesia y uso de aparatos estereotáxicos personalizados para el lechón
- Anestesiar a los animales utilizando una estación de trabajo de anestesia con un ventilador y dispositivos de monitoreo apropiados, y monitorear parámetros fisiológicos como la oximetría de pulso, la presión arterial no invasiva, la electrocardiografía y la temperatura durante todo el experimento, como se describió anteriormente. Intubar y ventilar a los lechones y administrar anestesia con sevoflurano a 1 concentración alveolar mínima (MAC) (aproximadamente 2,5-3%) durante 3,5 h. Asegúrese de que el personal capacitado del laboratorio esté presente para estos experimentos. El pelo que cubre el área quirúrgica se elimina con tijeras eléctricas antes de la preparación de la piel.
nota: La concentración y la duración del anestésico utilizado permiten que el experimento simule la duración de la exposición real a la anestesia durante un procedimiento quirúrgico. Además, el sevoflurano es el anestésico general más utilizado en la población pediátrica, por lo que la investigación en torno a su seguridad es de suma importancia.
- Antes de la colocación en el marco estereotáxico, inicie una dosis de carga de rocuronio de 2,5 mg/kg y una infusión de 1,5 mg/kg/h para evitar el movimiento del animal mientras está asegurado en el marco.
- Coloque al lechón en el marco estereotáxico específico para lechones una vez que se confirme una profundidad adecuada de anestesia mediante un pinzamiento de los dedos del pie.
- Proporcione un acolchado adecuado dentro del marco estereotáxico colocando al lechón sobre una almohadilla térmica de aire forzado con acolchado adicional (p. ej., posicionador fluidizado) para prevenir úlceras por presión.
- Coloque los dientes de la mandíbula superior sobre la barra dentaria (Figura 3).
nota: La barra dental debe estar a un nivel suficiente para mantener el cráneo firmemente en su lugar.
- Fije y apriete las barras penetrantes dentro de las orejas, teniendo cuidado de asegurarse de que el lechón esté en la posición de la línea media. Coloque las puntas puntiagudas de las presas laterales dentro del canal auditivo e inserte las barras auriculares con la suficiente firmeza como para escuchar el sonido "pop" asociado con la penetración de la membrana timpánica. Fije firmemente las barras de la oreja al cráneo e insértelas a la misma profundidad en cada lado para evitar el movimiento del cráneo durante el experimento (Figura 4, Panel A).
nota: Es de vital importancia mantener al lechón caliente (~ 37,8-38,6 °C) y controlar continuamente la temperatura durante todo el procedimiento para el mantenimiento de la normotermia. Esto se puede lograr a través de una manta y/o una lámpara de calor. Asegúrese de colocar la lámpara de calor a una distancia adecuada para evitar quemaduras en la piel del animal.
- Realice una incisión de 4 a 6 cm en la línea media a lo largo del cráneo, con precaución para evitar perforar el cráneo con el bisturí. Una vez hecha la incisión, use una retracción suave y una disección roma para elevar el cuero cabelludo desde el cráneo. Frote suavemente el cráneo con una gasa para eliminar cualquier tejido conectivo y exponer las líneas de sutura (Figura 4, Panel B).
nota: No es necesario mantener la esterilidad durante los experimentos de no supervivencia. Sin embargo, la esterilidad debe mantenerse durante los experimentos de supervivencia.
- Refleje aún más el cuero cabelludo, si es necesario, para exponer el área de interés y determinar la ubicación prevista para la craneotomía (Figura 5, Panel A). Utilice un taladro quirúrgico para crear una ventana de craneotomía de aproximadamente 0,25cm2 (puede ser más grande o más pequeña dependiendo de los objetivos experimentales) que recubra la estructura de interés, teniendo cuidado de no lesionar la duramadre o el cerebro subyacente (Figura 5, Panel B). Utilice unas tijeras quirúrgicas finas para extirpar la duramadre que recubre el tejido cerebral (Figura 5, Panel C).
- Coloque el electrodo lo más verticalmente posible sobre el bregma asegurando el brazo metálico de la cabecera al micromanipulador de la estereotasa del lechón. Baje el electrodo tanto como sea posible sin tocar la superficie del cráneo. Registre las coordenadas del bregma (Figura 6, Panel A).
- Determinar las coordenadas antero-posterior y medial-lateral, así como la profundidad de la estructura de interés en relación con el brema. Determine las coordenadas estereotáxicas utilizando un atlas estereotáxico apropiado para la especie y la edad. En este caso, utilice un atlas estereotáxico desarrollado específicamente para lechones.
- Vuelva a colocar el electrodo de modo que tenga la ubicación antero-posterior y medial-lateral adecuada, asegurándose de que tanto el microelectrodo como el aparato estén perpendiculares a la superficie. Coloque el electrodo de pseudo-referencia debajo del cuero cabelludo, asegurando el contacto con el animal (Figura 6, Panel B).
- Lenta y suavemente, baje el electrodo a la profundidad adecuada en el cerebro usando el brazo estereotáxico. Para los últimos 2 mm, use un microaccionamiento hidráulico para conducir el electrodo a la ubicación exacta (Figura 6, Panel C).
nota: La posición del electrodo debe superponerse a la ventana de la craneotomía. La profundidad del electrodo variará dependiendo de la estructura cerebral de interés. No es necesario cerrar la incisión una vez finalizada la recopilación de datos en experimentos que no son de supervivencia.
>4. Medición de glutamato extracelular bajo anestesia con sevoflurano
- Asegúrese de que el lechón esté bajo control fisiológico continuo durante todo el procedimiento. Los lechones se anestesian por inhalación (a través de un cono facial) en preparación para el procedimiento.
- Después de la implantación del MEA, espere 30 minutos para permitir que el electrodo alcance la línea de base para asegurarse de que se obtendrá la medición correcta durante 3 h (Figura 7).
- La bupivacaína al 0,25% (1 mL/kg) se administra por vía subcutánea en el lugar de la cirugía para el tratamiento del dolor postoperatorio. Además, la buprenorfina de liberación sostenida se administra por vía subcutánea cada 72 h según sea necesario.
