Registro de la actividad neuronal del tejido del hipocampo desplegado mediante una matriz de microelectrodos penetrantes

Resumen

Fuente: Zhang, M., et al. Propagación de la actividad neuronal en una preparación del hipocampo desplegado con una matriz de microelectrodos penetrantes. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra el procedimiento para configurar una cámara de grabación con una matriz de microelectrodos penetrantes (PMEA) para capturar señales neuronales de un hipocampo desplegado. Este método nos permite estudiar la velocidad y dirección de propagación de la actividad neuronal dentro del hipocampo desplegado in vitro.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por la revisión ética animal apropiada.

1. Soluciones para la Cirugía y el Registro Experimental

1. Prepare un tampón de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) normal que contenga (mM) NaCl (cloruro de sodio) 124, KCl (cloruro de potasio) 3.75, KH₂PO₄ (fosfato de dihidrógeno de potasio) 1.25, MgSO₄ (sulfato de magnesio) 2, NaHCO₃ (bicarbonato de sodio) 26, dextrosa 10 y CaCl₂ (cloruro de calcio) 2. Utilice este aCSF normal para la recuperación de tejido después de la disección y para el sistema de lavado al comienzo del experimento.
2. Prepare aCSF de sacarosa que se usa durante la disección del hipocampo y contiene (mM): Sacarosa 220, KCl 2.95, NaH₂PO₄ (fosfato de dihidrógeno de sodio) 1.3, MgSO₄ 2, NaHCO₃ 26, Dextrosa 10 y CaCl₂ 2. Para inducir la actividad epileptiforme en la preparación del tejido intacto del hipocampo, se añada 4-aminopiridina (4-AP) al aCSF normal a una concentración de 100 μM.

>2. Colocación del hipocampo desplegado en la matriz de microelectrodos penetrantes (PMEA) para registrar la actividad neuronal

1. Para preparar la configuración experimental, llene un frasco con aCSF normal y otro frasco con aCSF 4-AP. En ambas botellas, burbujea 95% O₂/ 5% CO₂ desde el comienzo de cada experimento. Utilice un conector de tres válvulas para controlar qué solución se seleccionará durante un experimento. Conecte un tubo de vacío en la salida de la cámara para bombear la solución a un contenedor de polvo. Calentar la tubería antes de introducirla en la cámara de registro y mantener la solución a un nivel de temperatura controlada (35 °C).
2. Cuando la entrada y la salida de la cámara de grabación estén cerradas, utilice un gotero de pipeta de vidrio hecho a medida para transferir y colocar el hipocampo desplegado en la cámara. Bajo el microscopio, coloque el hipocampo desplegado con un pincel pequeño normal mientras el tejido flota en la solución. Coloque el hipocampo desplegado con el lado alveo hacia abajo, el área CA3 apuntando hacia afuera y el campo CA1 apuntando hacia el investigador.
3. Aspire con cuidado la solución en la cámara con una pipeta de vacío desde el borde de la cámara de registro para bajar el nivel de la solución hasta que la cámara se seque y el tejido se baje sobre la matriz. Luego, coloque con cuidado un anclaje de tejido hecho a medida (Figura 1) (No. 7 en Materiales y equipos específicos) en la parte superior del tejido para sostener el hipocampo desplegado en la matriz. Coloque unas gotas de solución en la cámara de registro para volver a llenarla y abra gradualmente la entrada y la salida para ajustar el caudal a aproximadamente dos gotas por segundo en la cámara de goteo IV.
4. Incubar el tejido en la cámara de registro con aCSF normal durante aproximadamente 1 minuto para recuperarse, luego cambie el suministro de solución a aCSF disuelto 4-AP y ajuste el caudal correctamente. Incubar el tejido en aCSF disuelto con 4-AP durante unos 5 a 10 minutos, y luego el investigador podría iniciar el software para registrar la señal cuando aparezca la actividad espontánea.

Resultados

Figura 1. Montaje experimental. (A) Se coloca una tapa de plástico con tornillos sobre los circuitos para protegerlos contra posibles daños por agua. La cámara de registro tiene tubos de entrada y salida para transportar el flujo de solución. Se utiliza un anclaje de tejido hecho a medida pegado con una malla de fibra de nailon para asegurar el tejido durante los experimentos. (B) I...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pincel pequeño	Lowe's	tem #: 105657 Modelo #: 90219	El que tiene el tamaño más pequeño en un paquete de pinceles normal
Herramienta de ayuda de vidrio pulido al fuego	N/A	N/A	Esta herramienta fue pulida al fuego y fabricada con las pipetas de vidrio Pasteur normales.
Aguja de vidrio hecha a medida	N/A	N/A	Esta herramienta fue pulida al fuego y fabricada con las pipetas de vidrio Pasteur normales.
Herramienta de vidrio hecha a medida con un lazo de alambre de metal	N/A	N/A	Esta herramienta fue pulida al fuego y fabricada con las pipetas de vidrio Pasteur normales con un bucle de alambre metálico remodelado.
Gotero de solución de vidrio hecho a medida	N/A	N/A	Esta herramienta se fabricó con las pipetas de vidrio Pasteur normales con las puntas cortadas y una cabeza de goma unida al extremo cortado.
Anclaje de tejido a medida	N/A	N/A	La malla de fibra de nailon se pegó en un anillo de alambre de cobre aislado. El anclaje de tejido fue sostenido por un micromanipulador.
Matriz de microelectrodos fabricada a medida	N/A	N/A	Para más detalles sobre la matriz, consulte Kibler, et al, 2011.
Circuitos de filtro y amplificadores hechos a medida para el array	N/A	N/A	Para más detalles sobre la matriz, consulte Kibler, et al, 2011.
Procesador de adquisición de datos 3400a	Laboratorios Microstar	N/A	Se trata de un sistema completo de adquisición de datos con convertidor A/D.