Preparación de un modelo de rata para evaluar la integridad de la vía visual mediante una configuración de electrofisiología

Abstract

Fuente: Nguyen, C. T. et al., Registro simultáneo de electrorretinografía y potenciales evocados visuales en ratas anestesiadas.J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra la preparación de un modelo de rata para estudiar la salud de la retina y la integridad de la vía visual. El potencial evocado visual y la electrorretinografía de referencia y los electrodos activos se conectan a la rata, seguido de la alineación de la plataforma con la rata frente al cuenco de Ganzfeld para una iluminación uniforme de la retina y el cierre de la jaula de Faraday para evitar interferencias externas.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preimplantación de electrodos crónicos de potencial evocado visual (VEP)

NOTA: Si se van a recoger señales simultáneas de electrorretinograma (ERG) y VEP, los animales deben ser implantados quirúrgicamente con electrodos VEP al menos 1 semana antes de la recogida de la señal.

1. Esterilizar el banco quirúrgico antes de la experimentación limpiándolo con clorhexidina (0,5% en etanol al 70%). Autoclave todo el equipo quirúrgico antes de su uso. Cubra al animal con un paño quirúrgico esterilizado. Asegúrese de que todos los experimentadores usen mascarillas quirúrgicas, batas y guantes esterilizados.
2. Inducir la anestesia con isoflurano al 3 - 3,5% con_O2 a un caudal de 3 L/min. Mantener la anestesia al 1,5% y 2 L/min durante toda la cirugía. Asegure una profundidad suficiente de la anestesia mediante la ausencia de reflejo de pellizco de la pata.
3. Aplique carboximetilcelulosa sódica al 1% en la córnea para evitar la sequedad de los ojos.
4. Afeita un área de 30 mm x 30 mm sobre la frente, posterior a los ojos y anterior a las orejas.
5. Coloque al animal sobre una almohadilla térmica (37 ° C) para mantener la temperatura corporal y estabilizar la cabeza del animal con un marco estereotáxico.
6. Desinfecte el área afeitada con povidona yodada al 10% tres veces. Para el área cercana al ojo, evite el uso de antisépticos a base de alcohol, de acuerdo con el Estándar de Práctica establecido por la Asociación de Tecnólogos Quirúrgicos.
7. Haga una incisión mediano-sagital en la cabeza con un bisturí y a partir de este extraiga un círculo de tejido dérmico de ~ 20 mm de diámetro para exponer el hueso craneal.
8. Retire el periostio subyacente raspando y secando con gasa para exponer las suturas craneales coronales y sagitales.
9. Usando una fresa dental unida a un taladro, trepanar dos orificios (0,7 mm de diámetro, profundidad ~ 1 mm) a través del cráneo en ambos hemisferios en las coordenadas estereotáxicas: 7 mm caudal a bregma, 3 mm lateral a la línea media.
10. Atornille tornillos de acero inoxidable (diámetro 0,7 mm, longitud 3 mm, esterilizados con clorhexidina) en los dos orificios prefabricados hasta una profundidad de ~ 1 mm (2 mm de tornillo expuesto) para permitir un anclaje firme. Esto entra en contacto con la duramadre sin dañar el tejido cortical subyacente.
11. Prepare el área quirúrgica para la amalgama dental secando el hueso craneal con una gasa y retrayendo la piel suelta con dos suturas 3 - 0 a las ~ 4 y 8 en punto.
12. Extienda la amalgama dental sobre el cráneo expuesto para asegurar los electrodos de tornillo (tornillos de acero inoxidable descritos en el paso 1.10) en su lugar. Asegúrese de que ~ 1,5 mm de los tornillos permanezcan expuestos para la grabación.
13. Retire las suturas de retracción.
14. Inyectar carprofeno al 0,5% por vía subcutánea (5 mg/kg) para analgesia y solución salina (cloruro de sodio 0,9%, 1,5 ml) por vía subcutánea para la reposición de líquidos.
15. Permita que los animales se recuperen en jaulas separadas. No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
16. No devuelva al animal a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado completamente de la cirugía (mínimo 5 días).
17. Continuar administrando carprofeno al 0,5% por vía subcutánea para analgesia (5 mg/kg) una vez al día durante 4 días.
18. Registre ERG y VEP 1 semana después de la cirugía.

>2. Grabación ERG y VEP

1. Preparación de la recopilación de datos
   1. Utilice el software de la computadora para activar simultáneamente el estímulo y adquirir datos de acuerdo con la configuración recomendada a continuación.
      1. Amplifique las señales (ERG: ×1.000, VEP: x10.000) con la ganancia ajustada internamente por un preamplificador y un amplificador aislados, y con ambos ojos emparejados para la impedancia.
      2. Establezca la frecuencia de muestreo para el ERG en 4 kHz en una ventana de grabación de 650 mseg (2.560 puntos), Para hacer esto, haga clic en la pestaña de "base de tiempo" en el software de adquisición de datos (para el nombre y la versión del software, consulte la Tabla de materiales), seleccione "2,560" para muestras y "500 ms" para el tiempo, lo que devolverá una ventana de grabación de 650 mseg.
         1. Utilice el mismo método para establecer la frecuencia de muestreo del VEP en 10 kHz durante una época de 250 mseg. Permita una línea de base de preestímulo de 10 mseg para los registros ERG y VEP. Para hacer esto, haga clic en la pestaña "Configuración"; seleccione "Estimulador" para que aparezca una nueva ventana de diálogo; en esa ventana, seleccione "pulso" de la lista desplegable para "Modo"; y establezca el valor de "Retraso" en "10 ms".
      3. Establezca el filtrado de paso de banda ERG en 0,3 - 1.000 Hz (- 3 dB). Esto se hace haciendo clic en "Bio Amplifier" en el software de adquisición de datos. A continuación, establezca el valor de "Paso alto" en "0,3 Hz" y el valor de "paso bajo" en "1 kHz".
      4. Utilizando el método mencionado anteriormente en 2.1.1.3, establezca la configuración de paso de banda VEP en 0,1 - 100 Hz (- 3 dB) según lo recomendado por la Sociedad Internacional de Electrofisiología Clínica de la Visión (ISCEV) para grabaciones VEP humanas.

>2. Preparación de electrodos

1. Personalice los electrodos ERG activo/inactivo y VEP activo/inactivo conectando alambre de plata o una pinza de cocodrilo a un cable de electrodo, respectivamente. Obtener comercialmente el electrodo de tierra.
2. Para los 4 electrodos hechos a medida, corte el extremo macho de la extensión del cable del electrodo. Retire 1 cm del revestimiento aislante exterior de politetrafluoroetileno con una hoja de bisturí asegurándose de que el cable interior no se dañe.
3. Prediseñe los electrodos inactivos ERG cortando un alambre de plata de 70 mm de longitud (0,3 mm de grosor) y formando un bucle de ~ 8 mm de diámetro para rodear el ojo de rata. Prepare un círculo uniforme dando forma al bucle en una punta de pipeta de 1 ml.
4. Prediseñe los electrodos inactivos VEP cortando una longitud de 70 mm de plata y formando una elipse de ~ 8 mm de diámetro longitudinal para engancharla a los incisivos de rata.
5. Preforme los electrodos activos ERG cortando un alambre de plata de 30 mm de longitud y formando un pequeño bucle para entrar en contacto suavemente con la córnea de rata (~ 1-2 mm de diámetro)
6. Fije de forma segura los electrodos (2 ERG activos, 2 ERG inactivos, 1 VEP inactivo) al cable del electrodo entrelazando la plata con el cable interno expuesto.
7. Aísle el exceso de metal expuesto con cinta adhesiva para reducir los artefactos fotovoltaicos.
8. En los electrodos inactivos ERG, pegue un pequeño trozo de cierre de velcro (~ 5 mm × 20 mm) a la cinta adhesiva para permitir una fijación estable a la correa del cuello para roedores.
9. Conecte la pinza de cocodrilo al cable interior de los cables de los electrodos para hacer que los electrodos VEP sean activos.
10. Antes de las grabaciones, galvanoplastia las superficies expuestas de los cables de plata (es decir, el anillo inactivo y la punta activa) con cloruro utilizando una fuente de 9 V CC durante 20 segundos para mejorar la conducción de la señal.
    1. Para hacer esto, sumerja la punta de plata del cable del electrodo ERG (que actúa como el ánodo de una celda primaria) en solución salina normal y conecte el otro extremo de este cable de electrodo al terminal positivo de una batería de 9 V.
    2. Conecte otro cable (el cátodo) al terminal negativo de la batería y sumerja también el otro extremo en solución salina. Desconecte después de 20 segundos y observe que la punta plateada del cable del electrodo ERG se cubre uniformemente de color blanco.
       NOTA: Prepare nuevos electrodos ERG para cada sesión experimental (~ hasta 8 horas) para garantizar la permeabilidad del recubrimiento de cloruro.

>3. Preparación animal

1. Adapte a los animales a la oscuridad durante la noche (≥ 8 horas) antes de las grabaciones en una habitación hermética a la luz. Garantice la máxima adaptación a la oscuridad apagando las luces de la habitación y cerrando todas las puertas y persianas. Minimice las fugas de luz colocando materiales a prueba de luz alrededor de las uniones de puertas / ventanas y colocando pantallas de computadora fuera de cortinas negras gruesas.
2. Lleve a cabo la preparación de los animales en una habitación oscura con la ayuda de un diodo emisor de luz roja tenue (LED; 17,4 cd.m-2, λ_max = 600 nm) para mantener la sensibilidad de los bastones.
3. Anestesiar a la rata inyectando ketamina/xilacina (60: 5 mg/kg) por vía intramuscular. Confirme la profundidad suficiente de la anestesia por la ausencia de un reflejo de pellizco de la pata.
4. Para mantener la sedación, administre una dosis adicional de anestesia (50% de la dosis inicial) después de 50 min si es necesario.
5. Para anestesia tópica adicional, aplique una gota de proxymetacaína al 0.5% en cada ojo y elimine el exceso de líquido.
6. Para la dilatación de la pupila, aplique una gota de tropicamida al 0,5% en cada ojo, luego seque el exceso de líquido.

>4. Posicionamiento de electrodos ERG y VEP

1. Coloque al animal en la plataforma ERG frente al cuenco de Ganzfeld situado en la jaula de Faraday. Evite el uso de una almohadilla térmica eléctrica, ya que puede introducir ruido eléctrico en las grabaciones electrofisiológicas><. NOTA: La plataforma está unida a una plataforma de agua calentada circulante para mantener la temperatura corporal.
2. Asegure al animal a la plataforma con una tira de cierre de velcro colocada firmemente pero no apretada alrededor de la nuca.
3. Enganche el electrodo VEP inactivo alrededor de los incisivos inferiores de la rata anestesiada.
4. Coloque los electrodos inactivos ERG rodeando el anillo escleral de forma no invasiva alrededor del ecuador del ojo. Estabilice esto colocando electrodos en la tira de cierre de velcro alrededor de la nuca. Repita para el ojo contralateral.
5. Fije los electrodos activos VEP colocando pinzas de cocodrilo en tornillos de acero inoxidable preimplantados en el cráneo.
6. Coloque una pequeña gota de carboximetilcelulosa sódica al 1% en la córnea antes de colocar el electrodo activo ERG para mejorar la calidad de la señal.
   NOTA: El líquido viscoso también ayuda a mantener la hidratación corneal durante la experimentación para minimizar la formación de cataratas de tipo desecación en roedores.
7. Coloque una pequeña gota de carboximetilcelulosa sódica al 1% en los incisivos inferiores para mejorar el contacto del electrodo inactivo VEP y, por lo tanto, la calidad de la señal.
8. Coloque los electrodos activos ERG para tocar ligeramente la superficie central de la córnea utilizando un micromanipulador conectado a un brazo estereotáxico hecho a medida.
9. Inserte 2 - 5 mm del electrodo de aguja rectificado (acero inoxidable) por vía subcutánea en la cola.
10. Si es necesario, seque el exceso de líquido del párpado inferior antes de grabar para mejorar la calidad de la señal.
11. Deslice la plataforma más cerca del cuenco de Ganzfeld asegurándose de que los ojos del animal estén alineados con la abertura del cuenco para permitir una iluminación uniforme de ambas retinas (ver paso 2.4.1).
12. Cierre la jaula de Faraday para reducir el ruido superfluo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinza de cocodrilo	Marca genérica	HM3022	Clip de acero inoxidable de 26 mm para conectar electrodos de tornillo VEP a cables
Bioamplificador	ADInstrumentos	ML 135	Para amplificar señales ERG y VEP
Carboximetilcelulosa sódica 1,0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Fluido viscoso para mejorar la calidad de la señal del electrodo ERG activo
Carprofeno 0,5%	Grupo de Salud Animal de Pfizer	CAS 53716-49-7	Nombre común: Rimadyl inyectable (50 mg/mL). Para la analgesia postoperatoria, diluida al 0,5% (5 mg/mL) en solución salina normal
Clorhexadina 0,5%	Laboratorios Orión	27411, 80085	Para la desinfección de instrumental quirúrgico
Baño de agua circulante	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Para el mantenimiento de la temperatura corporal del animal anestesiado durante la cirugía y los registros electrofisiológicos
Amalgama dental	DeguDent GmbH	64020024	Para revestir el conjunto electrodo-cráneo para hacerlo más robusto
Fresa dental	Instrumentos Storz, Bausch y Lomb	#E0824A	Una cabeza de perforación en miniatura de ~0,7 mm de diámetro para hacer un pequeño orificio en el cráneo sobre cada hemisferio para implantar tornillos VEP
perforar	Bosch	Serie Dremel 300	Un taladro automático para trepanar
Cable de electrodo	Telefactor de hierba	F-E2-30	Cables de platino para conectar electrodos de alambre de plata al amplificador
Jaula de Faraday	Hecho a medida		Garantiza la resistencia a la luz para mantener la adaptación a la oscuridad. Incluye la configuración de Ganzfeld para mejorar la relación señal-ruido
Hisopos de gasa	Productos Médicos Multigate Pty Ltd	57-100B	Para secar la incisión quirúrgica y la superficie expuesta del cráneo durante la cirugía
Esfera integradora de Ganzfeld	Soluciones fotométricas internacionales		Estimulador de luz diseñado a medida: 36 mm de diámetro, tamaño de apertura de 13 cm
VELCRO	VELCRO Australia Pty Ltd	Envoltura reutilizable de la marca VELCRO	Cierre de velcro para asegurar los electrodos y el animal en la plataforma de grabación
Isoflurano 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Nombre Común: Isoflo(TM) Anestésico por inhalación. Anestésico inhalatorio de grado farmacéutico mezclado con gas oxígeno para la cirugía de implante de electrodos VEP
ketamina	Laboratorios Troya	Ilion Ketamil	Nombre patentado: Ketamil Injection, Marca: Ilium. Anestésico de grado farmacéutico para el registro electrofisiológico
LEDs Luxeon	Iluminación Phillips Co.		Para la estimulación lumínica veinticinco LEDs de 5 vatios y uno de 1 vatio.
Micromanipulador	Aparato de Harvard	BS4 50-2625	Mantiene el electrodo activo ERG durante las grabaciones
Electrodo de aguja	Telefactor de hierba	F-E2-30	Se inserta por vía subcutánea en la cola para que sirva como electrodo de tierra tanto para el ERG como para el VEP
Fenilefrina 2.5% mínimos	Bausch y Lomb	CAS 61-76-7	Instilado con tropicamida para lograr la máxima dilatación para el registro de ERG
Povidona yodada 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nombre del propietario: Betadine, Antiséptico para preparar la piel afeitada para la cirugía 10%, 500 mL
Sistema de adquisición de datos Powerlab	ADInstrumentos	ML 785	Controla los LEDs
Proxymetacaína 0.5%	Laboratorios Alcon	CAS 5875-06-9	Para la anestesia corneal durante las grabaciones ERG
Solución salina	Gelflex		No inyectable, para galvanoplastia de electrodos de alambre de plata
Software de alcance	ADInstrumentos	Versión 3.7.6	Activa simultáneamente el estímulo a través del sistema Powerlab y recopila datos
Plata (alambre redondo fino)	Metal A&E	0,3 milímetros	Se utiliza para fabricar electrodos ERG activos e inactivos, y el electrodo VEP inactivo
Tornillos de acero inoxidable	MicroFastners		0,7 mm de diámetro del eje y 3 mm de longitud para ser implantado sobre la corteza visual primaria y servir como electrodos VEP activos
Marco estereotáxico	David Kopf	Modelo 900	Un instrumento estereotáxico de pequeños animales para localizar las cortezas visuales primarias según las coordenadas del atlas del cerebro de ratas de Paxinos y Watson de 2007
Cuchilla quirúrgica	Swann-Morton Ltd.	Artículo 206	Para incidir el área de piel que recubre la corteza visual primaria para implantar los electrodos VEP
sutura	Shanghai Pudong Jinhuan Productos Médicos Co., Ltd		Sutura trenzada de seda 3-0 no absorbible, para la retracción de la piel durante la cirugía de implantación de electrodos VEP
Pomada oftálmica 0.3%	Laboratorios Alcon	CAS 32986-56-4	Nombre propio: Tobrex. Pomada antibiótica profiláctica aplicada alrededor de la herida cutánea después de la cirugía
Tropicamida 0,5%	Laboratorios Alcon	CAS 1508-75-4	Nombre patentado: 0,5% Gotas oftálmicas de midriacil, instiladas para lograr midriasis para la grabación de ERG
Xilacina	Laboratorios Troya	Ilion Xylazil-100	Anestésico de grado farmacéutico para el registro electrofisiológico
Punta de pipeta	Eppendorf Pty Ltd	0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL, para electrodos a medida
Inyección de letabarbo euthanazia	Virbac (Australia) Pty Ltd	LETHA450	325 mg/mL de pentobarbital sódico para la eutanazia rápida
Microsoft Office Excel	Microsoft	Versión 2010	Software de hojas de cálculo para el análisis de datos