Implantación de electrodos en la corteza de un ratón para registros electrocorticográficos

Resumen

Fuente: Dufort-Gervais, et al. Registro electrocorticográfico de áreas de la corteza cerebral manipuladas utilizando un virus adenoasociado dirigido a Cofilina en ratones. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra un protocolo para implantar electrodos electrocorticográficos en la corteza cerebral del ratón para registrar señales eléctricas en respuesta a virus adenoasociados que se dirigen y manipulan la expresión de cofilina.

Protocolo

1. Implantación de electrodos ECoG/EMG

1. Con pinzas Kelly rectas, atornille lentamente un electrodo ECoG (con alambre de oro recto) en el eje vertical en el orificio donde se inyectó el AAV. Deje al menos 2,5 mm del tornillo fuera del cráneo para minimizar el daño a la duramadre y la corteza cerebral (es decir, a una profundidad aproximada de 1,1 mm desde la superficie del cráneo; Figura 1D).
2. Marque la posición del electrodo ECoG posterior y del electrodo de referencia en el cráneo con un bolígrafo en estas coordenadas: electrodo posterior (corteza visual) 1,5 mm lateral derecho a la línea media y 1,5 mm anterior a lambda, electrodo de referencia (corteza somatosensorial) 2,6 mm lateral derecho a la línea media y 0,7 mm posterior al bregma. Además, marque la posición de tres tornillos de mantenimiento (que actúan como anclajes entre el cráneo y el cemento dental para solidificar el montaje de la cabeza) en el hemisferio izquierdo sin coordenadas específicas, pero lo más distantes posible entre sí y de los electrodos ECoG.
3. Perfore con cuidado el cráneo en la posición marcada de los otros electrodos y los tornillos de anclaje con la broca de 0,7 mm. Perfore en una dirección perpendicular a la superficie del cráneo para cada tornillo (es decir, eje vertical para el electrodo posterior, pero con un ángulo desde el eje vertical para otros sitios). Lave el cráneo perforado con una solución de povidona yodada al 10% y bloquee los agujeros con pequeños trozos enrollados de delicados limpiaparabrisas antes de instalar los tornillos para evitar el sangrado y la contaminación.
4. Con las pinzas Kelly rectas, atornille los tornillos de mantenimiento en el hemisferio izquierdo y luego atornille los dos últimos electrodos en el hemisferio derecho. Asegúrese de atornillar con el mismo ángulo en el que se perforaron los agujeros y de dejar al menos 2,5 mm de cada tornillo fuera del cráneo (Figura 1D).
   nota: Para maximizar la solidez del montaje final y la calidad de las señales electrofisiológicas, tenga cuidado de no tocar ningún tornillo al instalar el siguiente.
5. Coloque unas gotas pequeñas de cemento dental en el centro del espacio en forma de anillo dentro de los tornillos.
6. Cubra los ojos de los ratones y aplique luz durante 3-5 minutos para ayudar a la solidificación del cemento. Una vez que los electrodos EMG se sujeten firmemente, cubra la base de los electrodos ECoG y la base de los tornillos de anclaje con cemento dental para formar un contorno en forma de corona. Cubra los ojos de los ratones y aplique luz durante 3-5 minutos para ayudar a la solidificación del cemento.
   nota: No aplique cemento en las extremidades de los electrodos ECoG y EMG (el cable de oro que se soldará al conector) ni en la piel.
7. Rellena el centro del montaje con cemento acrílico previamente mezclado. Durante la solidificación del cemento, retire las cuatro pinzas quirúrgicas que sujetan la piel (y lávelas inmediatamente con limpiadores de trabajo delicados).
   nota: No aplique cemento en las extremidades de los electrodos ECoG y EMG (el cable de oro que se soldará al conector) ni en la piel.
8. Suturar la piel por la parte posterior y delantera del montaje para que el cráneo no quede expuesto (pero evitando estirar demasiado la piel) utilizando una aguja de sutura (13 mm 3/8 c) y monofilamento sintético absorbible.
9. Sostenga el conector por encima del montaje con pinzas curvas y alinee cuidadosamente el cable dorado de los electrodos con las clavijas del conector. Suelde los extremos del electrodo a las clavijas del conector con el soldador.
   nota: Proceda rápidamente para evitar el sobrecalentamiento y el daño al tejido cortical. Asegúrese de que cada electrodo haga buen contacto con el pin del conector correspondiente y que los electrodos no estén conectados entre sí.
10. Retire el ratón del marco estereotáxico. Cubra el espacio vacío entre el conector y la cabeza con cemento acrílico previamente mezclado cubriendo todas las conexiones entre los electrodos y las clavijas del conector.
    NOTA: Evite la infiltración de cemento dentro del conector sosteniendo el mouse con el conector por encima de la cabeza (cabeza recta, no inclinada).
11. Pese el mouse y colóquelo en una jaula limpia (preferiblemente equipada con una tapa sin malla) sobre una almohadilla térmica (carcasa individual para evitar daños en el montaje de la cabeza). Vigilar al animal con regularidad y administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea al despertar, y 12 h después si el animal muestra signos de dolor (p. ej., postura anormal, ojos entrecerrados)
    nota: El aumento de peso en relación con el peso previo a la cirugía no debe exceder de 1,5 g.

>2. Grabaciones

1. Aloje los ratones individualmente para evitar daños en el montaje de la cabeza como resultado del aseo mutuo, así como daños y enredos de los cables de grabación.
   nota: Para este protocolo, se alojó a los ratones con acceso ad libitum a comida, agua y un cubo de madera, y se realizó un seguimiento diario.
2. Conecte los ratones a los cables de grabación 2 semanas después de la cirugía para que se adapten a las condiciones del cableado.
3. Registre señales ECoG durante 24 horas (o más/menos dependiendo de las preguntas de investigación).

Resultados

Figura 1: Preparación de los componentes de montaje de ECoG/EMG y ejemplo representativo de la colocación de electrodos ECoG. (A) Un electrodo ECoG: un alambre de oro de 4 mm de largo y 0,2 mm de diámetro (no aislado) se fusiona en la cabeza de un tornillo cubierto de oro (1,9 mm de diámetro de cabeza, 1,14 mm de diámetro de rosca mayor, 3,6 mm de longitud total) utilizando soldadura...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja de 21 G	Terumo	NN-2125R
Conector de 6 canales	Distrelec	300-93-672	Posible reemplazo del conector descontinuado anterior
Ratones C57BL6/J	Laboratorio Jackson	000664 | B6	Animales criados en el lugar
Pluronic F-68			Tensioactivo no iónico
Alambre de oro de 0,2 mm de diámetro	Delta científico	920-862-41	No aislado
Jeringa Hamilton (10 μL)	Fisher Científico	14815279
bomba de jeringa de infusión CMA 402	Aparato de Harvard	CMA8003110
Cánula de inyección 28 G	Plásticos uno	C313L-SPCL
Isoflurano	Baxter	CA2L9100
Ketamina (10 mg/mL)	SANDOZ	4550
Soldadura sin plomo	objetivo	SN100C
Pomada oftálmica lubricante	ALLERGAN	210889
PE 50 Catéter de pared delgada	Plásticos uno	C232CT
Tornillos autorroscantes de cabeza de relleno plana	Morris	FF00CE125	Electrodo ECoG cubierto de oro; Dimensión : 1,9 mm de diámetro de la cabeza, 1,14 mm de diámetro mayor de la rosca, 3,6 mm de longitud
soldador	Weller	WES51
Jeringa 1 mL	Bd	309659
Cortapatillas	Aparato de Harvard	72-9063
Xilacina (20 mg/mL)	Bayer	2169592
Buprenorfina (0,3 mg/mL)	CEVA	57133-02
Pinzas curvas	Herramientas de alta ciencia	11001-12
Limpiaparabrisas para tareas delicadas	Kimtech	34120
Cemento acrílico dental	Yates Motloid	44115
Pinzas Kelly	Herramientas de alta ciencia	13002-10
Acrílico líquido	Yates Motloid	44119
Aguja de sutura Monocryl plus 13 mm corte 3/8c rev	Ethicon	MCP494
Providona yodada 10%	Triad desechables	10-8208
RelyX Unicem 2, Cemento de resina adhesiva A2	3M	56849