1. Configuración del aparato de pipeta de soplado
NOTA: Hay cinco componentes básicos para esta configuración: la pipeta de vidrio, el tubo, la jeringa, el micromanipulador y el tampón (de Hank) Tabla 1. Cualquier tampón que tenga concentraciones de sal fisiológicamente relevantes podría utilizarse en esta configuración.
- Tire de una pipeta de borosilicato para que tenga una punta de apertura de alrededor de 45 μm de diámetro utilizando un extractor de micropipetas y las especificaciones de la Tabla 2.
NOTA: Se encontró que 45 μm es un tamaño adecuado para el diámetro de la abertura de la pipeta en condiciones experimentales. Las ligeras variaciones en el tamaño de la apertura no deberían afectar significativamente a los resultados. Es importante tener en cuenta que las desviaciones más grandes de este número aún deberían funcionar para la inducción de varicosidad ajustando la altura de la jeringa que está conectada a la pipeta a través de un tubo, pero esto requerirá una recalibración del valor de presión.
- Inserte el extremo no extraído de la pipeta en un tubo de goma fino.
nota: La pared del tubo debe ser delgada y rígida para minimizar la resistencia del fluido, asegurando que la altura de la jeringa sea directamente proporcional a la presión del fluido que fluye a través de la pipeta con una resistencia insignificante. La tubería no debe tener más de 0,6 m de longitud para minimizar aún más la resistencia.
- Conecte el otro extremo del tubo a una jeringa de plástico de 10 ml a través de un conector con una válvula giratoria.
nota: La jeringa de plástico debe mantenerse a una altura constante y medible para garantizar una medición precisa de la presión supuesta que fluye de la pipeta. Se utilizó una altura de 190 mm, ya que proporciona una presión mínima pero induce varices en los axones de manera confiable. También se pueden utilizar otros valores de altura si la presión hace que las celdas se desprendan de la superficie de cubreobjetos. Se recomienda utilizar la misma configuración durante todo el experimento.
- Inserte la pipeta en la tapa de rosca del micromanipulador para mantener la pipeta en su lugar. Atornille el tornillo metálico de punta plana fijado al brazo del micromanipulador de modo que sujete el extremo de la pipeta sin tirar justo por encima de donde está unido el tubo de goma. Incline la pipeta en un ángulo de 45° con la superficie de los cubreobjetos que contienen neuronas. NOTA: El micromanipulador debe estar construido de manera que la pipeta pueda sujetarse sin constreñir el tubo de goma. El micromanipulador debe permitir el movimiento de la pipeta en las direcciones x, y y z para colocarla con precisión dentro del alcance de las células. A continuación se proporciona un gráfico y una fotografía del aparato (Figura 1).
- Encienda un filtro de fluorescencia, abra la apertura y asegúrese de que se pueda ver un punto fluorescente a través del objetivo. Con el micromanipulador, mueva la pipeta a una posición que alinee la punta con el punto fluorescente y baje la pipeta a una posición justo por encima de la altura de la placa de cultivo celular (35 mm x 10 mm). Una vez que esté en posición, encienda la luz transmitida y apague la fluorescencia.
- Con unas pinzas, agregue un cubreobjetos (con las células hacia arriba hacia la pipeta) de la placa de cultivo celular a la placa de cultivo celular que contiene aproximadamente 2 ml de tampón de Hank a temperatura ambiente.
- Coloque la placa de cultivo que contiene el cubreobjetos en el visor.
- Con la perilla de enfoque fino y el objetivo 20X, enfoque en un plano a unas cuatro vueltas completas por encima de las celdas (aproximadamente 0,4 mm). Utilice el micromanipulador para colocar la punta de la pipeta de modo que quede enfocada y en el centro, en el lado izquierdo del avión, tal como se ve a través de los oculares.
nota: Las dendritas son proyecciones que deben estar en el mismo marco que el cuerpo celular del que se originan. Para inducir varices axonales, se deben seguir proyecciones más largas desde el cuerpo celular hasta los axones medial y distal.
>2. Calibrar la presión de la pipeta utilizando un sistema de membrana estirable
- Configure el aparato de pipeta de inflado con exactamente los mismos parámetros que se describieron anteriormente sobre un sistema que contenga una membrana de silicona microfabricada (500 μm de diámetro y 50 μm de espesor) y enfoque el microscopio en la superficie de la membrana><.
nota: Este sistema fue diseñado para medir pequeños valores de presión, y una explicación del sistema ha sido publicada anteriormente. Esta medición solo debe realizarse una vez para los experimentos de resoplado si se utiliza exactamente el mismo ajuste de resoplado.
- Enfoque el microscopio en las matrices de micropuntos (4 μm de diámetro y 10 μm de separación, medidos entre centros). Gire la válvula de cierre y permita que el líquido salga de la pipeta. Examine la deflexión de la membrana en respuesta a la presión del fluido con un microscopio confocal.
- Utilice un modelo lineal para determinar la presión correspondiente asociada con la deflexión de la membrana.
nota: Si bien un estudio reciente encontró que se obtuvo una deflexión de w= -3,143 ± 0,69 μm para una altura de jeringa de 190 mm, esto produjo una presión de 0,25 ± 0,06 nN/μm2 con respecto a la configuración actual de la pipeta, que se encuentra dentro del rango fisiológico y patológico, aunque la altura de la jeringa no es el único determinante. Otros factores también influyen en el valor exacto de la presión sobre las neuronas, como la apertura de la pipeta, la posición (distancia y ángulo) de la punta de la pipeta en relación con las células e incluso la flexibilidad del tubo.
>3. Resoplar para inducir varices
- Una vez que la pipeta esté en posición, enfoque el microscopio en un plano que contenga una región de interés. Coloque las células y los procesos en la mitad izquierda del campo de imagen (visto por la captura en vivo de la cámara) dentro del área de soplado, mientras que la mitad derecha está fuera del área de soplado.
nota: Debido al extenso crecimiento de los axones y dendritas de las neuronas, es poco probable que todos los procesos de una neurona estén dentro de la misma área de inflamación. Esta es en realidad una ventaja de este sistema, que permite examinar el efecto local del soplado. Hay dos tipos de inhalación que se pueden utilizar para inducir varicesidades: inhalación de larga duración y resoplada de pulso.
- Fumando
- Resoplado de larga duración
- Coloque la jeringa a una altura, 190 mm por encima del cubreobjetos que contiene las neuronas cultivadas. Comience a obtener imágenes de lapso de tiempo del área de interés con un tiempo de exposición optimizado que revele una morfología neuronal clara. Capture al menos 15 fotogramas en un intervalo de 2 s (30 s en total) como línea base. El intervalo se puede ajustar en función del experimento. En el cuadro 16, abra la válvula de cierre giratoria de la jeringa y permita que el líquido fluya durante 75 marcos (150 s). En el cuadro 75, cierre la válvula para que se detenga el flujo de fluido. Detener la captura de video.
NOTA: Esto debería inducir varices axonales en las neuronas 7-9 DIV dentro de 5-10 s, mientras que las neuronas más viejas tardan más en formar varices.
- Pulso (2 s de duración) resoplando
- Coloque la jeringa a la altura adecuada (190 mm). Comience a tomar imágenes de lapso de tiempo y capture al menos 15 fotogramas (30 s) en un intervalo de 2 s. En el cuadro 16, abra la válvula de la jeringa y deje que fluya el fluido, luego cierre la válvula después de 2 s. Espere de 5 a 20 segundos (dependiendo de la frecuencia que se vaya a probar) antes de volver a abrir la válvula. Repita la apertura y el cierre de la válvula para crear pulsos de fluido y continúe durante un período total de 150-300 s. Continúe con las imágenes de lapso de tiempo durante 20 minutos para capturar la etapa de recuperación.
nota: Cuando el intervalo es superior a 10 s, los pulsos inducen drásticamente menos varicesidades. A un intervalo de 20 s, los pulsos no pueden inducir varices. Para obtener una formación de varicosas fiable y consistente, se recomienda que la altura de la jeringa sea de unos 190 mm. La altura de la jeringa y la presión del fluido no deben elevarse hasta un punto en el que las células comiencen a desprenderse de la superficie del cubreobjetos.
- Antes de un día de uso, limpie la configuración (pipeta, tubo y jeringa) haciendo fluir aproximadamente 10 ml de etanol al 70% a través de la configuración. Después del lavado con etanol, fluya 10 ml de tampón de Hank (o tampón deseado) a través de la configuración para preparar el sistema para el uso de ese día. Después de terminar los experimentos del día, limpie la configuración como se describió anteriormente con etanol para evitar el crecimiento de contaminantes durante la noche.
Tabla 1: La receta de tampón de Hank. Esta receta prepara el tampón utilizado en el protocolo de inflado y durante la obtención de imágenes de células vivas.
| tampón de Hank (filtro, pH = 7,4, almacenar a 4 °C |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | Kcl |
| 1,2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glucosa |
| 20 mM | HEPES |
Tabla 2: Parámetros de extracción de pipetas. Proporciona los parámetros que se deben configurar en el extractor de pipetas para obtener una abertura de alrededor de 45 μm de diámetro.
| Parámetros de extracción de pipetas |
| calor | tirar | velocidad | demorar | presión | rampa |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
