Electrónica de malla inyectable para grabaciones estables de una sola neurona en el cerebro de un ratón

Abstract

Fuente: Schuhmann Jr., T. G., et al. Electrónica de malla inyectable con jeringa para la electrofisiología estable de roedores crónicos. J. Vis. Exp. (2018).

El video muestra la inyección de sondas electrónicas de malla en el cerebro de un ratón para grabaciones estables a largo plazo a nivel de una sola neurona. Un ratón anestesiado con un cráneo expuesto se asegura en un marco estereotáxico, y la región del dispositivo de malla de la sonda se inyecta en el cerebro a través de orificios perforados. Las almohadillas de entrada-salida de la sonda están conectadas a un circuito, y las grabaciones se obtienen utilizando un sistema de adquisición de datos.

Protocol

1. Inyección estereotáxica de electrónica de malla en el cerebro de un ratón vivo

NOTA: Los ratones fueron anestesiados por inyección intraperitoneal con una mezcla de 75 mg/kg de ketamina y 1 mg/kg de dexdomitor. El grado de anestesia se verificó con el método de pinzamiento del dedo del pie antes del inicio de la cirugía. La temperatura corporal se mantuvo colocando al ratón sobre una manta homeotérmica a 37 °C mientras estaba bajo anestesia. Se implementó una técnica estéril adecuada para la cirugía, que incluyó, entre otros, la esterilización en autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos metálicos durante 1 h antes de su uso, el uso de guantes esterilizados, el uso de un esterilizador de perlas calientes durante toda la cirugía, el mantenimiento de un campo estéril alrededor del sitio quirúrgico, la desinfección de los instrumentos de plástico con etanol al 70% y la piel del cuero cabelludo depilada se preparó con yodóforo antes de la incisión. Para las cirugías de supervivencia, después de la conclusión de la cirugía, se aplicó una pomada antibiótica alrededor de la herida y el ratón fue devuelto a una jaula equipada con una almohadilla térmica de 37 °C. Los ratones no fueron dejados desatendidos hasta que hubieron recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Los ratones recibieron analgesia con buprenorfina mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal cada 12 h durante un máximo de 72 h después de la cirugía. Los ratones fueron aislados de otros animales después de la cirugía. Los ratones fueron sacrificados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital a una dosis de 270 mg/kg de peso corporal o mediante perfusión transcárdica.

1. Anestesia el ratón y fíjalo en un marco estereotáxico.
2. Aplique lubricante ocular en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
3. Use un taladro dental y un marco estereotáxico para abrir una craneotomía en las coordenadas deseadas en el cráneo. Abra una segunda craneotomía lejos del sitio de inyección para la inserción de un tornillo o alambre de conexión a tierra de acero inoxidable.
4. Fije un sustrato de sujeción al cráneo con cemento dental. Corte un espacio de aproximadamente 1 mm de ancho en el sustrato para mejorar la confiabilidad del paso de plegado más adelante en el procedimiento.
   nota: Un cable plano y flexible (FFC) cortado en forma de "L" funciona bien (Figura 4A), aunque muchos materiales funcionarían siempre que tengan el grosor correcto para el conector de fuerza de inserción cero (ZIF) de 32 canales (diseñado para cables de 0,18 ± 0,05 mm de grosor).
5. Monte el soporte de pipeta con la aguja que contiene la electrónica de malla en el marco estereotáxico mediante una abrazadera de extremo en ángulo recto (Figura 2C y Figura 3A).
6. Conecte la salida lateral del soporte de pipeta a una jeringa de 5 mL fijada en una bomba de jeringa (Figura 3D) utilizando un tubo capilar de aproximadamente 0,5 a 1 m de longitud.
   nota: Asegúrese de que no haya burbujas en el tubo capilar antes de conectarlo al soporte de pipetas. Las burbujas pueden interrumpir el flujo durante la inyección e impedir una entrega suave y controlada de la electrónica de malla.
7. Utilice el marco estereotáxico para colocar la punta de la aguja en el lugar de inicio deseado dentro del cerebro><. nota: Las sondas de electrónica de malla utilizadas aquí están diseñadas con electrodos de registro distribuidos en una longitud de aprox. 2 mm y con el primer electrodo situado a aprox. 0,5 mm del borde inicial de la electrónica de malla (borde más a la izquierda en la figura 1A). Por esta razón, las coordenadas estereotáxicas deben seleccionarse de manera que la ubicación inicial sea 0,5 mm más profunda que la región cerebral de interés. La distribución y la ubicación de los electrodos de registro dentro de la electrónica de malla se pueden seleccionar libremente durante el proceso de diseño de la máscara y deben seleccionarse de modo que los electrodos de registro abarquen las regiones cerebrales de interés a medida que se inyectan a lo largo de su trayectoria estereotáxica.
8. Coloque la cámara (Figura 3B) para mostrar la parte superior de la sonda electrónica de malla dentro de la aguja de vidrio. Algunos programas permiten al usuario dibujar una línea en la pantalla para marcar la posición original de la electrónica de malla.
9. Inicie el flujo ajustando la bomba de jeringa a una velocidad baja y presionando Inicio. 10 mL/h es un caudal de arranque típico para una aguja capilar de 400 μm de diámetro interior. Aumente lentamente el caudal si la sonda electrónica de malla no se mueve dentro de la aguja.
   nota: Es importante minimizar el volumen de líquido inyectado en el cerebro, ya que esto puede dañar el tejido que rodea el lugar de la inyección. Los mejores resultados se obtienen con volúmenes de inyección inferiores a 25 μL por 1 mm de longitud de malla inyectada. Los valores ideales son menos de la mitad de este volumen; en nuestro laboratorio, normalmente inyectamos de 10 a 50 μL por cada longitud de malla inyectada de 4 mm.
10. A medida que la sonda electrónica de malla comienza a moverse dentro de la aguja, use el marco estereotáxico para retraer la aguja a la misma velocidad con la que se inyecta la sonda electrónica de malla, utilizando la posición original marcada de la electrónica de malla como guía><. nota: Este procedimiento, denominado método de inyección de campo de visión (FoV), permite la entrega precisa de componentes electrónicos de malla a una región específica del cerebro sin arrugas ni dislocaciones. A menudo, el caudal se puede reducir una vez que la sonda electrónica de malla comienza a moverse dentro de la aguja. En nuestro laboratorio, a menudo se requieren caudales de 20-30 mL/h para superar la fricción estática entre la malla y las paredes de la aguja capilar, pero la tasa puede reducirse a 10 mL/h una vez que se ha iniciado el proceso de inyección. Los caudales y los volúmenes de inyección suelen ser más pequeños para las agujas capilares de menor diámetro.
11. Continúe fluyendo solución salina y retrayendo la aguja hasta que la aguja haya salido del cráneo. Detenga el flujo de la bomba de jeringa.

>2. Interfaz de entrada/salida

NOTA: En este punto, la sonda electrónica de malla se ha inyectado desde el punto de inicio deseado dentro del cerebro a lo largo de la trayectoria elegida. La aguja se ha retraído y está justo por encima de la craneotomía con las interconexiones electrónicas de malla que se extienden desde el cerebro hasta la aguja y las almohadillas de entrada/salida (E/S) aún dentro de la aguja (Figura 4B). Esta sección utiliza una placa de circuito impreso (PCB; Figura 4, Figura 5) para conectarse a la sonda electrónica de malla. La placa de circuito impreso conecta un conector ZIF a un conector amplificador estándar de 32 canales a través de un sustrato aislante que se convierte en el escenario principal para los experimentos de grabación neuronal. La placa de circuito impreso se puede personalizar para adaptarse a varias configuraciones de etapa principal. Nuestros archivos de diseño están disponibles a pedido o en el sitio web de recursos, meshelectronics.org, y se pueden utilizar para comprar PCB a bajo costo de proveedores de servicios de fabricación y ensamblaje de PCB.

1. Utilice el marco estereotáxico para guiar cuidadosamente la aguja hasta el sustrato de sujeción FFC y a través del espacio, haciendo fluir la solución con la bomba de jeringa para generar holgura en las interconexiones electrónicas de malla (Figura 4C).
2. Una vez que la aguja esté por encima del sustrato de sujeción y a través del espacio, reanude el flujo a una velocidad rápida para expulsar las almohadillas de E/S de la electrónica de malla sobre el sustrato de sujeción (Figura 4D).
3. Con unas pinzas y una pipeta de agua desionizada (DI), doble las almohadillas de E/S en un ángulo de aprox. 90° lo más cerca posible de la primera almohadilla de E/S.
   nota: La flexión es necesaria para permitir que las almohadillas se inserten en el conector ZIF de una placa de circuito impreso en un paso posterior. El conector ZIF tiene exactamente el mismo ancho que las 32 almohadillas de E/S de la sonda electrónica de malla, por lo que una curva imperfecta de 90°, o una curvatura que no ocurra justo antes de la primera almohadilla de E/S, resultará en tener que cortar las almohadillas de E/S (las almohadillas más a la izquierda en la Figura 4E).
4. Una vez que las almohadillas de E/S estén alineadas, desplegadas y en un ángulo de 90° con respecto al vástago de la malla, séquelas en su lugar con aire comprimido que fluya suave>nota: Las sondas electrónicas de malla con menos de 32 canales se pueden conectar con la misma placa de interfaz de 32 canales. Por ejemplo, nuestro laboratorio suele utilizar sondas electrónicas de malla de 16 canales con placas de circuito impreso de 32 canales. Esto proporciona espacio adicional dentro del conector ZIF, lo que facilita la interfaz, y los canales sin contacto adicionales se identifican fácilmente como circuitos abiertos mediante pruebas de impedancia durante las sesiones de grabación.
5. Corte el sustrato de sujeción en un borde recto aproximadamente a 0,5-1 mm del borde de las almohadillas de E/S. También corte las partes extrañas del sustrato de sujeción que dificultarán la inserción en el conector ZIF de 32 canales montado en PCB (Figura 4F).
6. Inserte las almohadillas de E/S en el conector ZIF de la PCB y cierre el pestillo (Figura 4G). Utilice la electrónica de medición para medir la impedancia entre los canales y el tornillo de tierra para confirmar la interfaz. Si los valores de impedancia son demasiado altos, desenganche el conector ZIF, ajuste la inserción y vuelva a probar hasta que se confirme que la conexión se ha realizado correctamente.
7. Cubra el conector ZIF y la electrónica de malla expuesta que se interconecta con el cemento dental para su protección. Voltee la placa de circuito impreso en el espacio en el sustrato y fije la placa de circuito impreso con cemento en el cráneo del ratón (Figura 4H).
   nota: Doblar el FFC en el espacio reduce la tensión mecánica que a veces puede romper las interconexiones electrónicas de malla.
8. Permita que el cemento se endurezca, convirtiendo la PCB en una etapa principal robusta y compacta para la interfaz durante las sesiones de grabación posteriores (Figura 4I).

>3. Experimentos de grabación neuronal

1. Coloque el ratón en un venador de cola u otro sujetador. Inserte la placa de circuito impreso del preamplificador en el conector del amplificador estándar en la placa de circuito impreso de la etapa principal. Utilice un cable separado para conectar a tierra el tornillo de referencia.
2. En el caso de las grabaciones restringidas, deje el ratón en el restricción. Registre los datos utilizando el sistema de adquisición de datos para el período deseado (Figura 5A).
3. Para grabaciones que se mueven libremente, suelte el mouse del retenedor después de insertar la PCB del preamplificador y conectar a tierra el tornillo de referencia. Registre durante el período de tiempo deseado utilizando el sistema de adquisición de datos mientras el mouse se comporta libremente (Figura 5B)

Results

Figura 1: Fotografías e imágenes de microscopio óptico de la electrónica de malla plug-and-play.(A) Imágenes de microscopio óptico en mosaico de una sonda electrónica de malla inyectable con jeringa con E/S plug-and-play. La sonda se fotografió después de la finalización de los pasos de fabricación en la Figura 2, pero antes de la liberación del sustrato recubierto d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bastidor estereotáxico motorizado	Instrumentos de precisión mundial	MTM-3	Para la cirugía estereotáxica en ratones
Controlador de grabación de 512 canales	Tecnologías Intan	C3004	Un componente del sistema de registro neuronal
Placa amplificadora RHD2132	Tecnologías Intan	C3314	Un componente del sistema de registro neuronal
RHD2000 cable de interfaz SPI ultradelgado de 3 pies	Tecnologías Intan	C3213	Un componente del sistema de registro neuronal
Protector de ratón	Braintree Científico	TV-150 STD	Diámetro interior estándar de 1,25 pulgadas; se utiliza para sujetar el ratón durante las sesiones de grabación restringidas.
Agujas capilares de vidrio	Drummond Scientific Co.		Diámetro interior 0,40 mm, diámetro exterior 0,65 mm. Otros diámetros están disponibles.
Soporte para micropipetas tipo U	Dispositivos Moleculares, LLC	1-HL-U	Se utiliza para sujetar las agujas capilares de vidrio durante la inyección estereotáxica
Jeringa de 1 ml	NORM-JECT,® Henke Sass Wolf		Se utiliza para la carga manual de componentes electrónicos de malla en agujas capilares
Tubo de catéter de polietileno intrademic	Becton Dickinson y compañía		Diámetro interior 1,19 mm, diámetro exterior 1,70 mm
Jeringa de 5 ml	Becton Dickinson y compañía		Utilizado en la bomba de jeringa para la inyección de electrónica de malla in vivo
Cámara ocular	Thorlabs Inc.	DCC1240C	Se utiliza para ver la electrónica de malla dentro de las agujas capilares durante la inyección
Software de adquisición de imágenes ThorCam uc480 para cámaras USB	Thorlabs Inc.		Se utiliza para ver la electrónica de malla dentro de las agujas capilares durante la inyección
Bomba de jeringa	Aparato de Harvard	Doctorado 2000	Se utiliza para hacer fluir volúmenes precisos de solución a través de agujas capilares durante la inyección de componentes electrónicos de malla
Taladro dental EXL-M40	Osada	3144-830	Para perforar la craneotomía
Fresa de perforación de 0,9 mm	Herramientas de Bellas Ciencias	19007-09	Para perforar la craneotomía
Esterilizador de perlas calientes 14 cm	Herramientas de Bellas Ciencias	18000-50	Se utiliza para esterilizar instrumentos quirúrgicos
Instrumento de criosección CM1950	Microsistemas Leica		Se utiliza para cortar tejido congelado en secciones. Muchas universidades tienen
Abrazadera final en ángulo recto	Thorlabs Inc.	RA180/M	Se utiliza para fijar el soporte de pipeta al marco estereotáxico
Placa de circuito impreso (PCB)	Circuitos Avanzados		Se utiliza para interactuar entre la electrónica de malla y la electrónica de medición periférica, como el sistema de registro Intan. Advanced Circuits y otros proveedores fabrican y ensamble PCB según los archivos de diseño proporcionados. Nuestros archivos de diseño de PCB están disponibles a pedido o en el sitio de recursos meshelectronics.org
Conector de amplificador estándar de 32 canales	Conector Omnetics Corp.	A79024-001	Componente ensamblado en la placa de circuito impreso
Cable flexible plano (FFC) de 32 canales	Molex, LLC	152660339	Se utiliza como sustrato de sujeción cuando se interactúa con almohadillas de E/S electrónicas de malla con el conector ZIF montado en PCB
Conector de fuerza de inserción cero (ZIF) de 32 canales	Hirose Electric Co., LTD	FH12A-32S-0.5SH(55)	Componente ensamblado en la placa de circuito impreso