Establecimiento de una configuración de pinza de voltaje de celda completa para registros electrofisiológicos en cortes de cerebro

Resumen

Fuente: Sunstrum, J. K., et al. Evaluación de la multiplicidad sináptica mediante electrofisiología de patch-clamp de célula completa. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra cómo colocar una pipeta de punta fina cerca de cortes de cerebro, formando un sello con una célula neuronal. La succión rompe la membrana celular, creando así una pinza de parche de celda completa que permite mediciones de corriente para experimentos de electrofisiología.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Soluciones

1. Solución de corte
   1. Consulte la Tabla 1 para conocer la composición de la solución de corte.
   2. Prepare una solución madre 20x con antelación y guárdela a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   3. Para la solución de corte 1x, disuelva NaHCO₃, glucosa y sacarosa en ddH₂O y agregue el caldo 20x. Asegúrese de que la osmolaridad esté entre 315 y 320 mOsm y almacene la solución durante no más de 1 semana a 4 °C.
   4. Llene dos vasos de precipitados con 100 ml de solución para cortar y cúbralos con parafilm. Enfríe la solución en un congelador hasta que se congele parcialmente (aproximadamente 20 min en un congelador de -80 °C). Usando un tubo de dispersión de gas, burbujee ambos vasos de precipitados con 95% de O2 / 5% de CO2 durante 20 minutos en hielo.
2. aCSF (líquido cefalorraquídeo artificial), para la recuperación y el mantenimiento de cortes
   1. Consulte la Tabla 1 para conocer la composición del aCSF.
   2. Prepare una solución madre 20x con antelación y guárdela a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   3. Para 1x aCSF, disuelva NaHCO3 y glucosa en ddH2O y agregue el caldo 20x. Asegúrese de que la osmolaridad esté entre 298-300 mOsm. Use la solución dentro de 1 día.
3. aCSF (Ca²⁺ bajo para grabación)
   1. Consulte la Tabla 1 para conocer la composición del Ca²⁺ aCSF bajo.
   2. Prepare una solución madre 20x con antelación y guárdela a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   3. Para 1x aCSF con bajo contenido de Ca²⁺, disuelva NaHCO3 y glucosa en ddH2O y agregue 20x (libre de CaCl2 y MgCl2), CaCl2 y MgCl2 a las concentraciones especificadas. Asegúrese de que la osmolaridad esté entre 298-300. Use la solución dentro de 1 día.
4. aCSF (Sr²⁺ para grabación)
   1. Consulte la Tabla 1 para conocer la composición del Sr²⁺ aCSF.
   2. Prepare una solución madre 20x con antelación y guárdela a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   3. Para 1x Sr²⁺ aCSF, disuelva NaHCO3 y glucosa en ddH2O y agregue 20x (libre de CaCl2 y MgCl2), SrCl2 y MgCl2 a las concentraciones especificadas. Asegúrese de que la osmolaridad esté entre 298-300. Use la solución dentro de 1 día.
5. Solución interna
   1. Consulte la Tabla 1 para conocer la composición de la solución interna a base de K-gluconato.
   2. Para hacer 20 mL de solución interna, agregue 15 mL de agua de grado de biología molecular a un tubo de 50 mL. A continuación, realice los siguientes pasos con hielo.
   3. Prepare las siguientes soluciones con anticipación a concentraciones de stock de 1 M en agua de grado de biología molecular. Añadir (en mL): 2,32 K-gluconato, 0,24 Na-gluconato, 0,20 HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico), 0,16 KCl, 0,05 K 2-EGTA (Etilenglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N,N'-ácido tetraacético), 0,04 MgCl2 al tubo de 50 mL.
   4. Añadir 100 μL de 0,3 M Na₃GTP (guanosina 5′-trifosfato sódico, sal)
   5. Pese 44,08 mg de K2 ATP (sal dipotásica de adenosina 5′-trifosfato) en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y agregue 1 mL de agua de grado de biología molecular, luego agregue a un tubo de 50 mL.
   6. Ajuste el pH a 7.2-7.4 con 1 M KOH. Asegúrese de que la osmolaridad esté entre 283-289 mOsm.

>2. Preparación de la rebanada

1. Preparación de herramientas
   1. Añada 200 mL de CSF a la cámara de recuperación (construida a partir de un vaso de precipitados de 250 mL con 4 pocillos y malla) y coloque la cámara de recuperación en un baño de agua (35 °C).
   2. Cubra la cámara con una película de parafina y burbujee constantemente el aCSF con 95% de O2/5% de CO2 utilizando un tubo de dispersión de vidrio durante al menos 20 minutos.
   3. Prepare las herramientas de disección (bisturí, tijeras finas en ángulo, pinzas, pincel fino, cuchara de plástico).
   4. Llene una jeringa de 60 ml con aproximadamente 15 ml de la solución de corte helada del paso 1.1.4.
   5. Prepare la plataforma de disección colocando papel de filtro en la tapa de una placa de pocillo.
   6. Prepare la cámara de corte colocándola en la bandeja de hielo y llenando la bandeja con hielo.
   7. Configure el vibratomo asegurando una cuchilla desechable en el soporte de la cuchilla.
   8. Para hacer una pipeta de transferencia, rompa la punta de una pipeta Pasteur y coloque una pera de goma sobre el extremo roto.
2. Diseccionar el cerebro del ratón
   1. Anestesiar al animal en una cámara saturada con isoflurano al 4% hasta que los reflejos espinales estén ausentes.
   2. Decapita al animal con una guillotina y extrae rápidamente el cerebro.
      1. Haga una incisión en la línea media con una hoja de bisturí n.º 22 desde la rostral hasta la caudal.
      2. Lateralmente, pela el cuero cabelludo a cada lado de la cabeza.
      3. Use tijeras finas para cortar el cráneo de un lado desde la caudal hasta la rostra, (incluido el lado de los huesos frontales), teniendo cuidado de no dañar el cerebro.
      4. Use fórceps para levantar la pieza del cráneo del cerebro y enfríe rápidamente el cerebro con 15 ml de solución de corte helada usando la jeringa del paso 2.1.4.
      5. Levanta el cerebro del cráneo.
      6. Coloque el cerebro en uno de los vasos de precipitados llenos de solución de corte helada (del paso 1.1.4) burbujeado con 95% de O2/5% de CO2.

>3. Prepare rodajas de hipotálamo de ratón.

1. Bloquee el cerebro para el área cerebral deseada y el ángulo de corte (p. ej., para cortes hipotalámicos coronales, recorte el tejido rostral al quiasma óptico y caudal a la protuberancia con una cuchilla y asegúrese de que el bloqueo caudal tenga una superficie plana perpendicular a la base del cerebro).
2. Con un trozo de papel de filtro cortado, levanta el cerebro de la parte anterior y pega la parte posterior a la placa de sujeción con pegamento instantáneo.
3. Coloque rápidamente la placa de sujeción en la cámara de corte y llénela con la solución de corte del segundo vaso de precipitados en el paso 1.1.4.
4. Asegure la cámara de corte y la bandeja de hielo en el vibrátomo.
5. Defina el área de corte (anterior y posterior al cerebro) y comience a cortar cortes coronales de 250 μm de grosor. Parámetros recomendados: velocidad 0,10 mm/s, amplitud 2 mm.
6. Recorte las rodajas al tamaño apropiado para el área del cerebro deseada.
7. Recuperar las lonchas a 35 °C durante 30-45 min. Luego, retire la cámara de recuperación del baño caliente y deje que las rodajas se recuperen a temperatura ambiente durante 30 minutos más. Mantenga las rodajas a temperatura ambiente durante el resto del día y continúe burbujeando el baño constantemente con 95% de O2 / 5% de CO2.

3. Clamp de parche de célula enteraGrabación

1. Tire de las pipetas de parche.​
   1. Utilizando los parámetros sugeridos para el registro de celda completa del manual del extractor de pipetas, extraiga pipetas de parche de vidrio de paredes gruesas hasta una resistencia de pipeta de 3-5 MΩ.
   2. Con una microjeringa (comercial o casera), llene la punta de una pipeta con una solución interna filtrada. Para hacer una micro jeringa, queme la punta de una jeringa de 1 ml y deje que la punta caiga, creando una punta larga y fina.
2. Obtenga la configuración de celda completa.
   1. Coloque la pipeta de registro justo encima de la rebanada y compense la corriente de la pipeta en el modo de pinza de voltaje. Aplique una ligera presión positiva a la pipeta y bloquee la llave de paso.
   2. Seleccione una célula sana con una membrana intacta y acérquese a ella con la pipeta. La presión positiva debe causar una ligera alteración en el tejido (es decir, una onda lenta en el tejido al entrar).
   3. Continúe acercando lentamente la pipeta a la célula con un movimiento diagonal hasta que la pipeta forme un pequeño hoyuelo en la superficie de la célula.
   4. Suelte el bloqueo de presión positiva. La celda comenzará a formar un sello y la resistencia aumentará por encima de 1 GΩ. En la pinza de voltaje, sostenga la celda a -68 mV.
   5. Aleje ligeramente la celda en diagonal para eliminar el exceso de presión de la celda.
   6. Compense la capacitancia rápida y lenta de la pipeta.
   7. Aplique una breve succión a través del tubo conectado al soporte de pipetas para atravesar la célula y obtener una configuración de célula completa.
   8. Cambie al modo Célula en la ventana de prueba de membrana en un software de adquisición y análisis de datos de electrofisiología (por ejemplo, Clampex).
   9. Antes de cada registro de pinza de voltaje, realice una prueba de membrana utilizando el mismo software y registre los parámetros relevantes en un libro de laboratorio (resistencia de la membrana, resistencia de acceso y capacitancia).
   10. Mantenga la temperatura del baño de registro entre 27 y 30 °C y el caudal entre 1,5 y 2,0 ml/min para experimentos posteriores.

Tabla 1: La composición de varias soluciones.

	Concentraciones de solución (mM)
	Rebanar	ACSF normal	Bajo Ca2+ aCSF	Sr+ aCSF	Pipeta/Interna
NaCl	Artículo 87	Artículo 126	Artículo 126	Artículo 126	-
Kcl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0.5	2.5	0.5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	número arábigo
NaH2PO4	1.25	1.25	1.25	1.25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
glucosa	25	10	10	10	-
sacarosa	75	-	-	-	-
K-gluconato	-	-	-	-	Artículo 116
Na-gluconato	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K 2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0.3

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 ml	Bd	309659
10 cuchillas	Fisher Scientific/otros	35698
22 cuchillas	VWR/otros	Números 21909-626
Filtros de jeringa de 22 uM	Milipore	09-719-000
Foreceps de Adson	Instrumentos de Harvard	72-8547
Tijeras afiladas en ángulo	Instrumentos de Harvard	72-8437
Clampex	Dispositivos moleculares	pClamp 10
Cuchilla de doble filo	VWR	74-0002
Papel de filtro	Sigma/otros	1001090
Pincel fino	Pescador/varios	15-183-35/varios
Tubo de dispersión de gas	VWR	LG-8680-120
Isoflurano	Fresenius Kabi/otros	M60303
Pegamento Krazy	varios	varios
Mini análisis	Synaptosoft	MiniAnálisis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Modelo 5600
Parafilm	sigma	PM-996
Pipeta Pasteur	VWR	14672-200
Medidor de pH	Mettler Toledo	FE20-ATC
Bombilla de goma	VWR	82024-550
Mango de bisturí n.º 3	Instrumentos de Harvard	72-8350
Mango de bisturí n.º 4	Instrumentos de Harvard	72-8356
Cuchilla de un solo filo	VWR	55411-050
Rebanadora de vibratome	Leica	VT1200S
Sistema de purificación de agua	Millipore	Milli-Q Académico A10
Tapa de la placa del pozo	Pescador/varios	07-201-590/Varios
CaCl2 2H2O	sigma	C7902
CdCl2	sigma	202908
EGTA	sigma	E3889
glucosa	sigma	G5767
HEPES	sigma	H3375
K2-ATP	sigma	A8937
Kcl	sigma	P9333
K-gluconato	sigma	G4500
MgCl2 6H2O	sigma	M2670
Agua de grado de biología molecular	sigma	W4502-1L
Na3GTP	sigma	G8877
NaCl	Biotienda	SOD001.1
Na-gluconato	sigma	S2054
NaH2PO4	sigma	71504
NaHCO3	sigma	S6014
Picrotoxina	sigma	Página 1675
SrCl	sigma	255521
sacarosa	Biotienda	SUC507.1