Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. pHuC_Mermaid Generación de plásmidos
NOTA: Mermaid es un biosensor desarrollado mediante el emparejamiento del dominio de detección de voltaje (VSD) del sensor de voltaje Ciona intestinalis (ahora Ciona robusta) que contiene fosfatasa (Ci-VSP) con los fluoróforos asociados de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) Umi-Kinoko Green (mUKG: donante) y una versión monomérica de la proteína fluorescente emisora de naranja Kusabira Orange (mKOk: aceptor). Para este biosensor, los cambios conformacionales del dominio VSD, inducidos por la despolarización de la membrana, aumentan la proximidad de las proteínas fluorescentes donante y aceptora, aumentando así la transferencia de energía entre ellas (aumentando la relación FRET). El VSD asegura la localización eficiente del biosensor en la membrana plasmática. La expresión neuronal del biosensor (en la médula espinal, la señal es detectable tanto en las interneuronas como en las neuronas motoras) se logra clonando el marco de lectura abierto Mermaid (ORF) bajo el promotor panneural de pez cebra HuC.
- Amplifique por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el marco de lectura abierto Mermaid (ORF) del plásmido Mermaid pCS4+ con ADN polimerasa Pfu (de corrección) utilizando el cebador universal T3 y el cebador Mermaid SmaI (5' TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) para insertar un sitio de restricción SmaI aguas arriba del Mermaid ORF.
- Utilice la siguiente mezcla de PCR: 0,5 μL de ADN polimerasa Pfu, 7,5 μL del tampón específico 10x, 1 μL de 10 mM de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP), 2,5 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,5 μL (50 ng) de la preparación de plásmidos y 1 μL de soluciones madre de 20 μM de cada cebador en un volumen total de 50 μL.
- Calentar la mezcla de PCR durante 15 s a 95 °C, prepararla durante 15 s a 50 °C y alargarla durante 4 min a 72 °C durante un total de 35 ciclos.
- Purifique en gel el producto de PCR contundente específico utilizando un kit de purificación en gel comercial, siguiendo el protocolo del fabricante.
- Clona el fragmento de ADN en el vector romo pCMV-SC siguiendo el protocolo del fabricante.
- Linealice el plásmido Mermaid positivo (denominado pCMV-SC_Mermaid) con la enzima de restricción SmaI para la siguiente inserción del promotor HuC.
- Configure la reacción de restricción de la siguiente manera: 0,5 μL (10 U) de enzima de restricción SmaI, 2 μL del kit tampón 10x y 5 μg de ADN plasmídico en un volumen total de 20 μL. Incubar la reacción a 25 °C durante 1 h.
- Purifique en gel el plásmido digerido utilizando un kit de purificación en gel comercial siguiendo el protocolo del fabricante.
- Amplifique por PCR el promotor de HuC (pHuC), con la ADN polimerasa de Pfu y el ADN genómico del pez cebra como plantilla, utilizando un par de cebadores específicos de HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA y HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) y que abarca una región de 3.150 pb aguas arriba del ATG.
- Configure la mezcla de PCR utilizando el siguiente esquema: 0,5 μL de ADN polimerasa Pfu, 7,5 μL del tampón específico 10x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 2,5 μL de DMSO, 200 ng de ADN genómico y 1 μL de soluciones madre de 20 μM de cada cebador en un volumen total de 50 μL.
- Después de un paso inicial de 2 minutos a 95 °C, caliente la mezcla de PCR durante 15 s a 95 °C, cebe durante 15 s a 50 °C y alargue durante 4 minutos a 72 °C durante un total de 35 ciclos.
- Purifique en gel el producto de PCR contundente específico utilizando un kit de purificación en gel comercial siguiendo el protocolo del fabricante.
- Ligar: una cantidad equimolar de la pCMV-SC_Mermaid purificada (paso 1.5) y del ADN pHuC (paso 1.7) utilizando 1 μL de ADN ligasa T4 y 1 μL del tampón 10X específico en un volumen total de 10 μL. Incubar la reacción durante 16 h a 4 °C.
- Transformar una alícuota de células competentes con 5 μL de la reacción de ligadura (paso 1.8) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Seleccione los clones positivos para pHuC (pHuC_Mermaid) con el promotor insertado en la orientación adecuada mediante una doble digestión Sal I-EcoRV (el sitio de restricción de SalI se ha insertado aguas arriba del fragmento promotor en el paso 1.6, mientras que el sitio de restricción EcoRV se coloca aguas abajo de la región de poliadenilación, PolyA, del plásmido pCMV-SC).
- Configure la reacción de restricción de la siguiente manera: 0,5 μL (10 U) de enzimas de restricción SalI y EcoRV, 2 μL del tampón kit10X y 1 μg de ADN pHuC_Mermaid en un volumen total de 20 μL. Incubar la reacción a 37 °C durante 1 h. Ejecutar las reacciones en un gel de agarosa.
>2. Microinyección de embriones
- Transfiera los huevos fertilizados obtenidos de pez cebra adulto tipo salvaje (cepa AB) o Sod1-G93R a una placa de Petri de 10 mm utilizando una pipeta de plástico.
- Enjuague los embriones con agua fría (4 °C) de pescado e inyéctelos inmediatamente en la yema con 200 pg de plásmido pHuC_Mermaid utilizando un microinyector (para una descripción general y detallada del procedimiento de microinyección).
- Con ayuda de una pipeta de plástico, transfiera los embriones a una placa de Petri e ínvelos en agua de pescado a 28 °C hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada (20-24 h después de la fertilización, hpf) para los siguientes análisis.
>3. Análisis de enrollamiento espontáneo de la cola
>NOTA: Evalúe el comportamiento espontáneo de enrollamiento de la cola en 20-24 embriones hpf con o sin el medicamento riluzol.
- Transfiera un embrión a una placa de Petri redonda de 90 mm llena de agua de pescado que contenga un 0,2% de DMSO (vehículo riluzol) y descorione manualmente con dos pinzas de joyero con puntas afiladas. Incubar el embrión durante 5 min.
- Detecte el enrollamiento de la cola a temperatura ambiente (RT) durante una grabación de video de 1 minuto utilizando una cámara digital montada en un microscopio estereoscópico. Adquiera series temporales con una resolución temporal de 30 fotogramas/s.
- Calcule la frecuencia de los enrollamientos espontáneos de la cola contando el número de curvas (tanto contralaterales como ipsilaterales) por unidad de tiempo.
- Para evaluar el efecto del fármaco riluzol, utilice suavemente una pipeta Pasteur de plástico para transferir el embrión a una nueva placa de Petri de 90 mm llena de agua de pescado que contenga 5 μM de riluzol.
- Incube el embrión durante 5 minutos antes de grabar un video de 1 minuto y realizar el análisis de comportamiento como se indicó anteriormente.
>4. Configuración de imágenes para la visualización de biosensores de sirena en embriones vivos: detección simultánea de señales de donantes y aceptores
- Monte los embriones de 20 a 24 hpf en agarosa de bajo punto de fusión al 1% en agua de pescado a 37 °C dentro de una placa de imagen con fondo de vidrio de 35 mm. Orienta los embriones de lado. Espere hasta que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.
- Transfiera la antena parabólica a la platina de un confocal invertido montado en un microscopio invertido. Identifique las neuronas motoras que expresan el biosensor con un objetivo de 20X (apertura numérica de 0,7, NA) excitando el mUKG con la línea láser de argón de 488 nm y registrando su emisión entre 495 y 525 nm.
- Para una medición FRET, excite mUKG, el donante del par FRET, con la línea láser de 488 nm. Detectar simultáneamente, con un escáner resonante que funciona a 8.000 Hz en modo bidireccional, la fluorescencia emitida por el donante (entre 495 y 525 nm) y la fluorescencia emitida por el aceptor mKOk (entre 550 y 650 nm, canal FRET). Si está disponible, utilice el láser de 473 nm.
nota: La eficiencia de excitación del donante se reducirá ligeramente (85% en lugar de 93% con 488 nm), pero también se reducirá la excitación cruzada del aceptor (del 17% con la línea láser de 488 nm al 9% con la línea láser de 473 nm).
- Para reducir la fototoxicidad y el blanqueo de fluoróforos, minimice la iluminación de la muestra reduciendo la potencia de la línea láser (en la ventana de trayectoria del haz del software de adquisición).
- Optimice la excitación para que coincida con los parámetros de ganancia y compensación que se establecen al comienzo del experimento y se mantienen constantes durante toda la sesión. Para establecer el desplazamiento, cambie el color de la imagen a valores de intensidad (utilizando la tabla de búsqueda Q) y, mientras escanea con el láser apagado, gire la perilla de desplazamiento (desplazamiento inteligente) para que los píxeles de fondo tengan una intensidad ligeramente superior a cero. Con la misma tabla de búsqueda, al encender el láser mientras escanea, gire la perilla de ganancia (ganancia inteligente) para maximizar la relación señal-ruido, teniendo cuidado de evitar píxeles saturados.
- Usando un orificio abierto (2 unidades aéreas), adquiera imágenes de 16 bits para proporcionar un rango dinámico suficiente para análisis cuantitativos. Evite promediar para aumentar la velocidad de adquisición y minimizar el fotoblanqueo.
- En la ventana de adquisición de software, seleccione un tamaño de campo de imagen de 512 x 64 píxeles (tamaño de píxel: 605 nm) en el menú desplegable.
- Desde la ventana del modo de adquisición, seleccione xyt (lapso de tiempo en un solo plano xy) en el menú desplegable y registre los cambios en el voltaje de las neuronas espinales del embrión adquiriendo un solo plano xy, configurando los parámetros de adquisición para grabar una imagen cada 30 ms durante 1 minuto.
- Para evaluar el efecto de la administración de riluzol sobre la despolarización de la membrana en la misma neurona, se adquirió un nuevo conjunto de datos 5 min después de la adición de agua de pescado que contenía 5 μM de riluzol.
- Para el análisis de FRET, utilice el Biosensor_FRET macro ImageJ (que expresa biosensores FRET de cadena simple).
- Evalúe la relación FRET de la membrana basal de cada neurona en t1 como ((FRET media - FRET fondo)/(Media donante - Fondo donante)), donde FRET y la intensidad media del donante es la intensidad media de fluorescencia calculada en la misma región de interés (ROI) dibujada alrededor de la célula para cada canal adquirido y FRET y el fondo donante es la intensidad de fluorescencia media calculada en un ROI del campo de visión sin la muestra fluorescente.
nota: Puede encontrar una descripción detallada paso a paso del uso del complemento en el sitio web de www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret.
- Utilice un software de gráficos para comparar la frecuencia, la amplitud y la duración de la despolarización entre diferentes paradigmas experimentales. Compare dos grupos utilizando una prueba t de Student no apareada y considere los valores medios como estadísticamente diferentes cuando P <0.05.
