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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación y anestesia animal
- Inducir la anestesia en el ratón con inhalación de isoflurano/oxígeno. Utilizar un 4% de isoflurano para la inducción de la anestesia y un 2-3% para el mantenimiento con un flujo de oxígeno de 2,5 L/min. Ajustar el porcentaje de isoflurano para el mantenimiento de la anestesia según el estado del ratón, es decir, los ratones pequeños y débiles requieren menos anestésicos. Confirme la anestesia adecuada, por ejemplo, aplicando una presión leve en la almohadilla para caminar de la extremidad posterior para verificar la ausencia de un reflejo de retirada del dolor.
- Controle la temperatura corporal del ratón mediante una placa calefactora termostática a 37 °C para evitar la disminución de la temperatura corporal durante la anestesia.
- Coloque el ratón con la nariz para el mantenimiento de la anestesia. Asegúrese de que el animal tenga suficiente suministro de oxígeno comprobando que la nariz no obstruya las vías respiratorias y que el animal respire de manera constante.
- Durante la grabación, controle si el ratón está suficientemente anestesiado observando la frecuencia respiratoria (aproximadamente 1 Hz en anestesia) y la ausencia de un reflejo de retirada con una presión leve. Aumente la concentración de isoflurano manualmente si la anestesia no es lo suficientemente profunda.
- Después de las mediciones, deje que el ratón se recupere en la placa calefactora o en el calor de una lámpara infrarroja hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal, durante aproximadamente 2-5 minutos. No deje al ratón desatendido y en compañía de otros ratones hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
>2. Medición de CMAP en extremidades anteriores
- Utilice los electrodos de aguja de 27 G para las mediciones CMAP de las extremidades anteriores. Consulte la Figura 1 para conocer los lugares recomendados de colocación de los electrodos.
- Coloque los electrodos en las extremidades delanteras de la siguiente manera.
- Coloque el ratón en la almohadilla térmica en posición supina y utilice cinta adhesiva para extender ambas extremidades anteriores a los lados del cuerpo (Figura 1B).
- Coloque los electrodos estimulantes (1 = ánodo y 2 = cátodo) por vía subcutánea a ambos lados de la extremidad anterior para alinearlos con el nervio del plexo braquial. Levante la piel para insertar la aguja perpendicularmente a través de la piel y empuje aproximadamente 5 mm de la aguja debajo de la piel sin perforar los músculos subyacentes.
- Coloque el electrodo de registro (3) por vía subcutánea sobre el músculo bíceps braquial levantando la piel. Coloque el electrodo de referencia (4) en las almohadillas para caminar a una profundidad de 3 mm en un ángulo de 30 grados. Coloque el electrodo de tierra (5) por vía subcutánea en el lado del ratón.
nota: Los electrodos están muy cerca unos de otros en esta configuración. Evite que los electrodos se toquen entre sí, ya que esto distorsiona la grabación.
>3. Adquisición de datos
- Inicie la estimulación presionando el botón de estímulo recurrente en la unidad controladora y gire la perilla del controlador de intensidad para aumentar el estímulo. Estimula todos los axones utilizando 1 pulso/s con una duración de estímulo de 0,1 ms. Seleccione la frecuencia y la duración correctas en los menús desplegables del software.
- Para alcanzar estímulos supramáximos (5-20 mA; en condiciones desmielinizantes de hasta 60 mA), aplique estímulos crecientes girando la perilla del controlador de intensidad hasta que la amplitud de la respuesta CMAP deje de aumentar. A partir de ahí, aumente aún más el estímulo en un 20% para asegurarse de que la amplitud del CMAP haya alcanzado su máxima respuesta. Finalice la estimulación presionando nuevamente el botón de estímulo recurrente.
- Utilice la herramienta de marcadores para indicar los siguientes puntos en el registro: inicio del estímulo, inicio de la respuesta, pico positivo máximo y pico negativo máximo (Figura 2).
- Determine la latencia (en ms) como un retraso desde el inicio del estímulo hasta el inicio de la respuesta (Figura 2). Defina el inicio de la respuesta como el punto más temprano donde la amplitud comienza a aumentar. Utilice la latencia para evaluar la desmielinización en los axones.
- Mida la amplitud (mV) desde el máximo negativo hasta el máximo pico positivo (Figura 2). Utilice la magnitud de la amplitud para correlacionar el número de axones funcionales.
