Registro electrofisiológico de las respuestas de voltaje de los fotorreceptores de la retina de Drosophila a los estímulos luminosos

Resumen

Fuente: Juusola, M., et al. Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular de los fotorreceptores e interneuronas de Drosophila a estímulos luminosos in vivo. J. Vis. Exp. (2016).

Este video describe el protocolo para el registro electrofisiológico de la actividad de los fotorreceptores en el ojo de una Drosophila inmovilizada, lo que permite una medición precisa de los cambios de voltaje en respuesta a estímulos luminosos.

Protocolo

1. Grabación de fotorreceptores R1-R6

1. Esté siempre conectado a tierra cuando opere el amplificador de microelectrodos (por ejemplo, tocando la superficie metálica de la jaula de Faraday o la mesa antivibratoria), ya que esto evita que uno entregue accidentalmente una carga estática a la etapa principal, lo que podría dañar los circuitos.
2. Ilumine el poste de la plataforma de preparación de moscas desde arriba con dos guías de luz de cuello de cisne (Figura 1A) (con la fuente de luz fría dentro de la jaula de Faraday) para que el soporte de moscas pueda colocarse en el poste en la posición preferida bajo un control visual cercano.
3. Monte el soporte para moscas (¡con la mosca dentro!) en el poste de la plataforma de preparación para moscas. Gire el soporte para moscas de modo que el ojo izquierdo de la mosca esté directamente frente al investigador (Figura 1B).
4. Inserte suavemente el electrodo de referencia romo a través de los ocelos de la mosca en la cápsula de la cabeza utilizando un pequeño micromanipulador grueso mientras observa la preparación a través del microscopio estereoscópico (Figura 1C). No empuje el electrodo demasiado profundo, ya que esto puede dañar el cerebro de la mosca.
   1. Alternativamente, inserte el electrodo de referencia en la parte posterior del tórax. Asegúrese siempre de que la mosca parezca sana (mueva sus antenas) y de que sus ojos estén intactos, no dañados accidentalmente. Si la preparación no parece inmaculada, prepara una nueva mosca para los experimentos.
5. Introduzca el microelectrodo de registro afilado en el ojo izquierdo a través de una pequeña abertura cubierta de vaselina. Utilice un gran aumento en el microscopio estereoscópico y mueva las guías de luz y el plano focal para que la ubicación de la punta del electrodo se haga evidente en 3D por sus patrones de reflectancia.
   NOTA: La Figura 1D muestra cómo debe colocarse la cabeza de la mosca (con respecto al ángulo en el que el microelectrodo de registro ingresa al ojo) para las grabaciones de fotorreceptores. Introducir el electrodo en el ojo sin romperlo es la fase más difícil del experimento. Si la punta del electrodo no llega a la pequeña abertura del ojo, golpeando la córnea, por lo general se rompe.
6. Encienda el amplificador de microelectrodos una vez que ambos electrodos estén firmemente dentro de la preparación, en contacto eléctrico con los fluidos corporales de la mosca.
7. Apague la fuente de luz fría (dentro de la jaula de Faraday) y desconéctela de la red eléctrica. Conecte su enchufe a la tierra central para minimizar el ruido eléctrico inducido por el bucle de tierra y aleje las guías de luz de cuello de cisne para que el sistema de brazo de Cardan se pueda mover libremente alrededor de la mosca. Apague las luces de la habitación para asegurarse de que la preparación de moscas esté ahora en relativa oscuridad.
8. Mida la resistencia del electrodo registrador en el ojo. Utilice únicamente electrodos de registro en los que la resistencia sea de 100 a 250 MΩ.
   nota: Lograr registros intracelulares de alta calidad con un electrodo de <70 MΩ es prácticamente imposible. Si la resistencia es de <80 MΩ, es probable que la punta del electrodo esté rota. En este caso, apague el amplificador y cambie el electrodo de registro.
9. Configure el amplificador en el modo de grabación de pinza amperimétrica (CC) o puente. Cancele cualquier diferencia de voltaje arbitraria entre los electrodos de registro y de referencia, ya que ambos ahora descansan en el espacio extracelular interconectado eléctricamente, ajustando el desplazamiento de la señal (voltaje de registro) a cero. Siga los cambios de compensación de la señal utilizando la lectura de la pantalla del amplificador o la pantalla de un osciloscopio.
10. Espere 2-3 minutos para que el ojo de mosca se adapte a la oscuridad.
11. Introduzca la punta del electrodo registrador más profundamente en el ojo con pequeños pasos de 0,1 a 1 micra. Haga esto con un piezo-stepper del eje x de un micromanipulador controlado a distancia o girando suavemente la perilla de resolución fina de un manipulador manual.
12. Estimule el ojo de la mosca con breves destellos de luz (1 a 10 mseg) a medida que el electrodo de registro avanza en el tejido.
    nota: Si el electrodo de registro se coloca en la retina y el ojo funciona normalmente, cada destello de luz causará una breve y pequeña caída en el voltaje (hiperpolarización de 0,2 a 5 mV), llamada electrorretinograma (ERG). Este cambio en el potencial de campo del espacio extracelular es causado por la respuesta colectiva de las células de la retina a la luz.

Resultados

Figura 1. Colocación del portamoscas y los electrodos para los experimentos. (A-B) El portamoscas se coloca en la plataforma de grabación que también proporciona control de temperatura a través de un elemento Peltier (A: plataforma redonda blanca en el centro). El brazo de Cardan permite el posicionamiento exacto del estímulo luminoso a una distancia igual (a través de la rotación x,y) alrededor de l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio estereoscópico con zoom para la preparación de la mosca	Olimpo	Oculares SZX12 DFPLFL1.6x PF: WHN30x-H/22	Capaz de un aumento de ~150X con una larga distancia de trabajo; soporte de montaje en mesa de acero pesado a medida
Microscopio estereoscópico en la configuración intracelular	· Olimpo	Olympus SZX7; oculares: WHN30x-H/22	Se necesitan oculares de 30X para ver bien los reflejos de la punta del electrodo cuando se introduce a través del pequeño orificio corneal en el ojo
Microscopio Nikon	Nikon SMZ645; oculares: C- W30x/7
Mesa antivibratoria	Melles Griot	Con agujeros métricos M6 en la placa de pruebas	Nuestros equipos a medida tienen un gran agujero perforado a través de la gruesa placa de pruebas que deja entrar el poste de la plataforma de preparación de moscas (alberga un disipador de calor de cobre con electrónica) desde abajo
Newport
Micromanipuladores	Narishige	Narishige NMN-21	En nuestras configuraciones intracelulares, se utilizan diferentes sistemas de micromanipuladores para introducir los electrodos de registro de Shap en el ojo de la mosca. Todos los manipuladores enumerados están proporcionando con éxito grabaciones estables y duraderas de fotorreceptores y LMC de Drosophila.
Huxley Bertram	Eje xyz de Huxley con control manual fino
Sensapex	Sensapex triple eje
Märzhäuser	Märzhäuser DC-3K con paso piezoeléctrico de eje x adicional y controlador MS 314
Soportes magnéticos	Cualquier base magnética con interruptor de encendido/apagado servirá		Por ejemplo, para gestionar los cables dentro de la jaula de Faraday
Portaelectrodos	Aparato de Harvard	ESP/W-F10N
Alambre de plata	Instrumentos de precisión mundial	AGW1510	0,3 - 0,5 mm de diámetro; necesita ser cloruroso para los portaelectrodos
Fuente de luz de fibra óptica	Muchos diferentes, incluido el Olimpo
Haces de fibra óptica	Tecnología UltraFine		Para entregar el estímulo de luz LED al sistema de brazo cardán. Utilizamos guías de luz líquida y de cuarzo (van desde UV hasta IR)
Laboratorios Thorn
Tubo de catéter para moscas		P80-50P 50ml Cent. Tubo PP., Paquete de 100 Uds	Corta la parte inferior cónica del tubo de centrífuga de plástico de 50 ml y pégale una punta de pipeta de 1 ml.
Sistema de Adquisición Digital	Instrumentos Nacionales
Amplificador de microelectrodo de pinza de corriente/voltaje de un solo electrodo	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ productos/amplificadores/seg-single- electrode-clamp/sec-10lx.html	¡Intérprete excepcional!
Escenario de cabeza	Estándar (+/- 150 nA)	Para npi SEC-10LX
Fuentes de luz LED y controladores	OptoLED de 2 canales (Cairn Research Ltd., Reino Unido)		Muchos de nuestros sistemas de estímulo son construidos internamente
Diseñado y construido por uno
Software de Adquisición y Análisis	Muchas empresas para elegir		Biosyst; sistema basado en Matlab escrito a medida para el trabajo experimental y teórico en el laboratorio de Juusola
Computadora personal o Mac			Asegúrese de que la PC o Mac sea compatible con el sistema y el software de adquisición de datos
Sistema de brazo cardán	Diseñado y construido por uno		Proporciona un posicionamiento x, y, z preciso de los estímulos luminosos
Sistema de control de temperatura Peltier	Diseñado y construido por uno
Jaula de Faraday	Construcción propia		Blindaje electromagnético contra el ruido
Capilares de vidrio de borosilicato filamentado		Diámetro exterior: 1 mm
Diámetro interior: 0,5 - 0,7 mm
Capilares de vidrio de cuarzo filamentado		Diámetro exterior: 1 mm
Diámetro interior: 0,5 - 0,7 mm
Extractor de pipetas	Compañía de instrumentos Sutter	Modelo P-2000 Tirador de micropipetas láser Flaming/Brown	Para los electrodos de referencia de borosilicato, utilice el programa preestablecido #11 (electrodos de parche): Calor = 350; Filamento = 4; Velocidad 36; Delay = 200).1.2.1). Para los electrodos de registro de borosilicato, use el programa preestablecido # 12 (esto generalmente extrae buenos objetos punzantes convencionales para registros de fotorreceptores): Calor = 355; Filamento = 4; Velocidad 50; Retraso = 225; Tirón = 150. En el caso de las grabaciones de LMC, que requieren electrodos con puntas más finas, es necesario ajustar estos valores. Para la extracción de capilares de cuarzo, el manual P-2000 sugiere programas para Microelectrodos de punta fina. Los parámetros preestablecidos de estos programas sirven como puntos de partida útiles para modificaciones sistemáticas para generar electrodos con buen éxito de penetración y bajo ruido de grabación.
Solución de timbre extracelular para el electrodo de referencia	Productos químicos de Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacarosa	Ver la receta en la sección de protocolo
Solución de KCl 3 M para el llenado del microelectrodo de registro filamentado	Sales de Fisher Scientific	10010310, KCl
vaselina	Vaselin

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