Monitoreo de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra inmovilizada

Resumen

Fuente: Lunsford, E. T., et al. Actividad de las neuronas aferentes de la línea lateral posterior durante la natación en el pez cebra. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra el registro de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra paralizada colocando una micropipeta cerca del ganglio de la línea lateral y formando un sello suelto para la captura de señales. La solución extracelular mantiene la viabilidad neuronal durante este proceso.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de materiales para registros electrofisiológicos

1. Haz un plato de grabación con fondo de elastómero de silicona.
   1. Dispense una capa delgada de componentes de elastómero de silicona automezclables (por ejemplo, Sylgard) en una placa de cultivo de tejidos con fondo de vidrio hasta que se nivele con el borde de un pozo poco profundo. Aproximadamente 0,5 mL es suficiente.
   2. Tapar y curar el plato durante un mínimo de 48 h a temperatura ambiente.
2. Haz alfileres de disección.
   1. Usando una fuente de alimentación de CC, proporcione una carga negativa (5 V) a un vaso de precipitados de 100 mL de grabador (3M KOH) y conecte un cable de tungsteno (0,002 pulgadas; 50,8 μm de diámetro) a la salida cargada positivamente><. cautela: Los cables negativos y positivos no deben entrar en contacto entre sí durante este procedimiento, ya que puede correr el riesgo de producir chispas, lo que podría representar un peligro potencial de incendio.
   2. Grabe el alambre de tungsteno sumergiendo rápida y repetidamente la punta en el baño de grabador hasta que la punta se estreche hasta convertirse en una punta afilada. Bajo un microscopio estereoscópico, corte el alambre aproximadamente a 1 mm de la punta con una cuchilla de afeitar de borde recto. Repita tres veces más y luego inserte los alfileres en la placa de grabación curada con pinzas finas.
3. Prepare los electrodos de registro.
   1. Utilizando un extractor de micropipetas horizontal con filamento de caja, extraiga un tubo capilar de vidrio de borosilicato (diámetro interior: 0,86 mm, diámetro exterior: 1,50 mm) en electrodos con una punta de 30 μm de diámetro con una ligera conicidad (Figura 1 Ai) que se utilizará para registrar las neuronas aferentes de la línea lateral posterior.
   2. Tire de un tubo capilar de vidrio de borosilicato adicional en un par de electrodos con diámetros de punta más pequeños (1-5 μm). Sosteniendo un electrodo en cada mano, pase suavemente las puntas entre sí para romperlas en un ángulo de ~ 30 °. Con una microforja, pula la punta biselada hasta que quede suave.
4. Generar el protocolo en programas de registro de electrofisiología.
   1. Asegúrese de que la etapa de cabeza correcta esté conectada a la entrada del canal 1 en la parte posterior del amplificador de pinza de corriente y voltaje del microelectrodo para las grabaciones de neuronas aferentes.
      NOTA: Las especificaciones de la computadora para el amplificador de pinza de corriente y voltaje requieren como mínimo un procesador de 1 Ghz o superior, Windows XP Pro o Mac OS X 10.46.6, una unidad de CD-ROM con 512 MB de RAM, 500 MB de espacio en el disco duro y 2 puertos USB.
   2. Abra el software del amplificador controlado por computadora.
   3. Configure el canal 1 en modo de pinza amperimétrica haciendo clic en el botón IC.
   4. Introduzca el siguiente parámetro en la pestaña I-Clamp 1: Salida primaria: 100x Potencial de membrana de CA (100.000 mV/mV), Ganancia: 1.000, Bessel: 1 kHz, CA: 300 Hz, Alcance: Derivación. Salida secundaria: 100x potencial de membrana de CA (100 mV/mV), ganancia: 1, filtro de paso bajo: 10 Hz.
   5. Guarde el parámetro de canal como Ch1_Aff.
   6. Instale y abra el software de electrofisiología de la abrazadera de parche.
   7. Haga clic en Configurar y seleccione Lab Bench para configurar las señales analógicas agregando Ch1_Aff a los canales del digitalizador (por ejemplo, Analog IN #0 y Analog IN #1) conectados por cable coaxial BNC a las salidas escaladas del canal 1 correspondientes del amplificador. Haga clic en OK.
      NOTA: Los requisitos mínimos de computadora para el digitalizador son: un procesador de 1 Ghz o superior, Windows XP Pro o Mac OS X 10.46.6, unidad de CD-ROM de 512 MB de RAM, 500 MB de espacio en el disco duro y 2 puertos USB.
   8. Haga clic en Adquirir y seleccione Nuevo protocolo.
   9. En la pestaña Modo/Velocidad, seleccione Libre de intervalos; en Modo de adquisición, establezca Duración de prueba en Usar espacio disponible en disco (es decir, grabar hasta que se detenga) o establecer una Duración deseada (hh:mm:ss), y luego establezca la Frecuencia de muestreo por señal (Hz) en 20.000 para maximizar la resolución.
   10. En la pestaña Entradas, seleccione los canales de entrada analógica que se configuraron previamente (en el paso 1.4.6) y seleccione Ch1_Aff para el canal correspondiente.
   11. En la pestaña Salidas, seleccione Cmd 0 y Cmd 1 para el canal #0 y el canal #1, respectivamente.
       1. Conecte el comando del canal 1 en el amplificador a la salida analógica 0 en el digitalizador a través del cable coaxial BNC.
   12. Las pestañas restantes pueden permanecer en la configuración predeterminada. Haga clic en Aceptar y guarde el protocolo.

>2. Preparación de la solución

1. Prepare la solución de Hank: 137 mM de NaCl, 5.4 mM de KCl, 0.25 mM de Na₂HPO₄, 0.44 mM de KH₂PO₄, 1.3 mM de CaCl₂, 1.0 mM de MgSO₄, 4.2 mM de NaHCO₄; pH 7.3. Diluir al 10% la solución de Hank añadiendo el volumen adecuado de agua desionizada al caldo.
2. Prepare la solución extracelular: 134 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,2 mM de MgCl₂, 2,1 mM de CaCl₂, 10 mM de glucosa y 10 mM de tampón HEPES, pH 7,8 ajustado con NaOH. Filtre al vacío la solución extracelular a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm.
3. Preparar α -bungarotoxina: Disuelva 1 mg de α-bungarotoxina liofilizada en 10 ml de solución extracelular para producir una dilución del 0,1%.
4. Preparar la solución de eutanasia: MS-222 de grado farmacéutico tamponado al 50% (mg/L) en solución de Hank's al 10%
   PRECAUCIÓN: α-bungarotoxina es una potente neurotoxina que paraliza los músculos al bloquear los receptores colinérgicos. Se requieren guantes y se recomienda protección para los ojos mientras se manipula el paralítico.

>3. Preparación de larvas para registros electrofisiológicos

1. Inmoviliza las larvas de pez cebra.
   1. Utilice larvas de la población de pez cebra criada en laboratorio (Danio rerio; 4-7 días después de la fertilización) y aloje en solución de embriones (solución de Hank al 10%) a 27 °C.
   2. Con una pipeta de transferencia de punta grande, transfiera la larva de la carcasa a una placa de Petri pequeña (35 mm) y elimine la mayor cantidad posible de la solución circundante.
      nota: La extracción de la solución embrionaria evita la dilución del paralizante y aumenta su eficacia. La esquina de una toallita se puede usar para absorber la solución embrionaria restante, y es fundamental no entrar en contacto con las larvas ni dejarlas expuestas al aire.
   3. Sumerja las larvas en 10 μL de α-bungarotoxina al 0,1% durante aproximadamente 5 min.
      nota: El tiempo necesario para inmovilizar las larvas varía de una preparación a otra. Una preparación saludable depende de monitorear de cerca el flujo sanguíneo rápido sostenido y la disminución de las respuestas motoras. La sobreexposición breve al paralítico puede conducir a un deterioro lento en la salud general de la preparación, incluso después de un lavado completo. Lo mejor es aplicar un lavado antes de que la larva esté completamente inmovilizada, mientras aún muestra signos de vibraciones musculares sutiles.
   4. Lavar la larva paralizada con la solución extracelular y bañar durante 10 min.
      nota: El lavado permite que la larva pase de las sutiles vibraciones musculares a la parálisis completa. Además, la α-bungarotoxina es un antagonista de la subunidad α9 del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), que es un componente crítico del circuito de retroalimentación endógena que observa este protocolo; sin embargo, se ha demostrado que este efecto es reversible en las células ciliadas de Xenopus y pez cebra después de un lavado de 10 minutos.
2. Coloque el pescado en el plato de grabación.
   nota: No se requiere anestesia (p. ej., MS-222, tricaína) mientras se preparan larvas de pez cebra (4-7 dpf) ya que interfiere con la salud animal. De hecho, las larvas de pez cebra están exentas de ciertos protocolos de vertebrados.
   1. Con una pipeta de transferencia, mueva la larva del baño de solución extracelular a la placa de registro con fondo de silicona. Llene el resto del plato con la solución extracelular.
   2. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque suavemente las larvas con pinzas de punta fina sobre el centro de la estera de silicona, con el lado lateral hacia arriba, con los extremos anterior y posterior del cuerpo corriendo de izquierda a derecha, respectivamente. A continuación, agarre un alfiler grabado de la estera de silicona con pinzas de punta fina e inserte el alfiler, ortogonalmente a la silicona, a través de la notocorda dorsal de las larvas directamente dorsal al ano. Inserte el segundo alfiler a través de la notocorda cerca del final de la cola e inserte el tercer alfiler a través de la dorsal de la notocorda de la vejiga de gas (Figura 1B).
      nota: Al insertar los clavos, es importante apuntar al centro del ancho de la notocorda para evitar afectar el flujo sanguíneo o dañar la musculatura circundante. La notocorda es dorsal al nervio de la línea lateral posterior, por lo que con la fijación adecuada, no se espera daño a las neuronas sensoriales de la línea lateral. Insértelo después del primer contacto para no alterar el tejido circundante. Idealmente, el diámetro del pin es menos de la mitad del ancho de la notocorda para garantizar una inserción limpia. Si los pines superan este ancho, repita el paso 1.2 hasta alcanzar el ancho de pin deseado. Si el flujo sanguíneo se ralentiza después de la colocación de clavos, repita desde el paso 1.3 en adelante con una nueva muestra.
   3. Inserte el cuarto pin a través de la vesícula ótica mientras proporciona una ligera rotación hacia la parte anterior a medida que el pin se inserta en el encapsulante (Figura 1B). A medida que se aplica una ligera rotación, observe el tejido entre el clítoris y la vesícula ótica para revelar el grupo de somas aferente>nota: La inserción en ángulo del cuarto clavo es para asegurar la exposición del ganglio aferente de la línea lateral posterior, que de otro modo estaría obstruido por la gran vesícula ótica.

4. Grabación de neuronas aferentes

1. Llene el electrodo de registro aferente con 30 μL de la solución extracelular, insértelo en el soporte de pipeta de la etapa de cabeza derecha (Figura 1B, C) y bájelo en la solución de placa mientras aplica presión positiva (1-2 mm Hg) producida por un transductor neumático.
2. Localiza y se adhiere sin apretar al ganglio aferente de la línea lateral posterior.
   1. Con un micromanipulador, baje la punta del electrodo aferente hasta que esté en posición por encima del clítoris.
   2. Aumente el aumento a 40x de inmersión y localice la intersección de la línea lateral posterior, el nervio y el clítoris. Siga el nervio de la línea lateral anterior desde el clítoris hasta donde las fibras inervan el ganglio aferente de la línea lateral posterior, distinguible por el grupo discreto de soma (Figura 1F).
   3. Coloque la punta del electrodo sobre el ganglio aferente y baje la pipeta hasta que la punta entre en contacto con el epitelio. Maniobre suavemente el electrodo de modo que toda la circunferencia de la punta entre en contacto con el ganglio aferente.
   4. Aplique presión negativa (20-50 mm Hg) con el transductor neumático y manténgalo presionado.
      nota: La presión negativa aplicada al ganglio aferente es suave. El aumento de la presión negativa puede mejorar la relación señal-ruido, pero la salud de las neuronas aferentes disminuye bajo una succión agresiva sostenida, lo que disminuye la probabilidad de una grabación exitosa.
3. Registra la actividad de las neuronas aferentes.
   1. La etapa de cabeza izquierda debe estar conectada al amplificador, que transmite la señal amplificada a un digitalizador que emite dicha señal en el software de electrofisiología de la abrazadera de parche para ser monitoreada en una computadora adyacente.
   2. En pClamp10, haga clic en el botón Reproducir en la barra de herramientas para monitorear las neuronas aferentes.
   3. Asegúrese de que el registro de las neuronas aferentes en toda la célula se logre una vez que los picos ocurran espontáneamente, aproximadamente cada 100-200 ms (Figura 1E).
   4. Gradualmente, aumente la presión del electrodo de registro de neuronas aferentes de nuevo a la atmosférica (0 mm Hg) y manténgala durante el resto del registro.

Resultados

Figura 1: Registro electrofisiológico simultáneo de la actividad de la neurona aferente de la línea lateral posterior y de la raíz motora ventral. (A). Ejemplo de un parche suelto de electrodos de registro aferente (i) y raíz motora ventral (ii). Las barras de escala representan 50 μm. (B) Las larvas de pez cebra se paralizan y se fi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vaso de precipitados de 100 ml	pyrex	1000	Receptáculo para grabador
Objetivo de inmersión en agua 10x	Olimpo	UMPLFLN10xW	Bajo aumento para el posicionamiento de las larvas y el electrodo de registro
Objetivo de inmersión en agua 40x	Olimpo	LUMPLFLN40XW	Mayor aumento para la posición de la punta del electrodo y el establecimiento de la abrazadera de parche
Cables coaxiales BNC	ThorLabs (en inglés)	2249-C-12	Conexión de canales de amplificador y digitalizador; requiere 4
Capilares de vidrio de borosilicato con filamento	Instrumentos Warner	G150F-3	Diámetro interior: 0,86, diámetro exterior: 1,50; vidrio capilar utilizado para formar electrodos de registro
ordenador	N/A	N/A	Cualquier ordenador debería funcionar
Fuente de alimentación de CC	Tenma	72-420	Se utiliza para grabar eléctricamente clavijas de disección
Digitalizador de electrofisiología	Instrumentos Axon, Dispositivos Moleculares	Axon DigiData 1440A	Permite la adquisición de datos de patch-clamp
filamento	Compañía de instrumentos Sutter	FB255B	Filamento de caja de 2,5 mm utilizado en el extractor de micropipetas
Pinzas finas	Herramientas de Bellas Ciencias	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) N.º de artículo 11295-10	Se utiliza para manipular larvas e insertar alfileres
Microscopio DIC de platina fija	Olimpo	BX51WI	Microscopio utilizado para visualizar y establecer registros de patch-clamp
Punta de pipeta flexible y cónica	Fisher Científico	02-707-169	Las puntas flexibles permiten la inserción en el electrodo de registro para dispensar la solución extracelular en la punta
Plato fluorado	Instrumentos de Precisión Mundial Inc.	FD3510-100	Plato de grabación con fondo de vidrio
KimWipe (Toallita Kim)	KimTech	34155	Toallita de trabajo utilizada para absorber el exceso de líquido de las larvas
Kwik-Gard	Instrumentos de Precisión Mundial Inc.	710172	Elastómero sylgard automezclable
Amplificador de microelectrodos	Instrumentos Axon, Dispositivos Moleculares	MultiClamp 700B	Amplificador de pinza de parche para grabaciones de doble canal
Microforja	Narishige	Microforja MF-830	Para pulir el electrodo de registro
Unidad de control del micromanipulador	Siskiyou	MC1000-eR/T	Coordinador de dial de 4 ejes para el control del micromanipulador
Extractor de micropipetas	Compañía de instrumentos Sutter	Flamígero/Marrón P-97	Para tirar del vidrio capilar en los electrodos de registro
Unidad de control de microscopio	Siskiyou	MC1000e	Posiciona el microscopio alrededor de la platina fija y la preparación
Micromanipulador motorizado	Siskiyou	MX7600	Posiciona la cabecera y el electrodo de registro adjunto para el registro de patch-clamp
Comandante MultiClamp	Dispositivos moleculares	2.2.2	Descargable desde la página de descarga de Axon MultiClamp 700B Commander
Mesa de aire óptica	Corporación de Newport	VH3036W-OPT	Mesa de aislamiento de placa de pruebas para flotar en el microscopio y minimizar las vibraciones durante las grabaciones
pCLAMP	Dispositivos moleculares	Artículo 10.7.0	Descargable desde la página de descarga del software de adquisición y análisis de datos de electrofisiología Axon pCLAMP 10
Placa de Petri	halcón	35-3001	Se utiliza para sumergir larvas en paralíticos
Soporte para pipetas	Dispositivos moleculares	1-HL-U	Sostenga el electrodo de grabación y conéctelo a la cabecera
Transductor neumático	Instrumentos biomédicos de Fluke	DPM1B	Para controlar la presión interna del electrodo de registro
Hidróxido de potasio	Sigma-Aldrich	221473-25G	Grabador para clavijas de disección
Tubo de silicona	Tygon	14-169-1A	Tubo para conectar el transductor neumático al soporte de pipeta
Microscopio estereoscópico	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Se utiliza para visualizar las puntas de los alfileres y durante la preparación de las larvas
Hoja de afeitar de borde recto	Canopus	Pedido de amazon.com	Corta el alambre de tungsteno mientras hace clavijas de disección
jeringa	Becton Dickinson Compoany	309602	Relleno de solución extracelular para inyectar en electrodos de registro
Pipeta de transferencia	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Pipeta no estéril de un solo uso para la transferencia de larvas
Metanosulfonato de tricaína	Syndel	Año 12854	Antextético farmacéutico utilizado para eutanasia de larvas con dosis altas.
Alambre de tungsteno	Instrumentos de Precisión Mundial Inc.	715500	0,002 pulgadas, 50,8 μm de diámetro; se utiliza para hacer clavijas de disección
Unidad de filtración al vacío	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Unidades de filtración al vacío, estériles y de un solo uso utilizadas para esterilizar la solución extracelular utilizada para el anillo de electrodos de electrofisiología
Pinza de voltaje Pinza de corriente	Dispositivos moleculares	CV-7B	Se suministra con amplificador MultiClamp 700B utilizado como cabeceras izquierda y derecha
α-bungarotoxina	ThermoFisher	B1601	Para inmovilizar las larvas antes de la grabación