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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de cortes de cerebro agudos en el hipocampo
- Preparación de soluciones de lonchas
- Prepare 500 mL de solución de corte de sacarosa compuesta por: 194 mM de sacarosa, 30 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 10 mM de D-glucosa, 1 mM de MgCl2, 1,2 mM de NaH2PO4 y 26 mM de NaHCO3, 290-300 mOsm, saturadas con 95% deO2 y 5% de CO2.
- Prepare 1-2 litros de solución de registro (líquido cefalorraquídeo artificial, ACSF) compuesta por: 124 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM de D-glucosa, 2 mM de CaCl2, 1,2 mM de NaH2PO4 y 26 mM de NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 (después del burbujeo), 290 - 300 mOsm, saturado con 95% deO2 y 5% de CO2. Llene un vaso de precipitados que contenga una cámara portacerebros con una solución de grabación y manténgalo a 32-34 °C. Llene la cámara del vibratomo con aguanieve de agua helada.
- Preparación aguda de lonchas
- Anestesiar profundamente a un ratón colocándolo en una campana precargada con 2-3 mL de isoflurano. Verifique el reflejo de pellizco del dedo del pie y, si no responde, decapitarlo rápidamente con un par de tijeras afiladas o guillotina, según lo requiera su protocolo animal.
- Haga una incisión de 2-3 cm con unas tijeras de la porción caudal del cráneo para cortar el cuero cabelludo a lo largo de la línea media. Mientras retrae manualmente el cuero cabelludo, haga dos incisiones horizontales de 1 cm desde el foramen magnum a lo largo de los lados del cráneo. Luego, con unas tijeras finas, corte una incisión a lo largo del cráneo, a lo largo de la línea media desde la parte posterior del cráneo hasta la nariz.
- Con pinzas finas insertadas cerca de la línea media, retraiga el cráneo inciso en dos porciones. Extraiga el cerebro de ratón del cráneo y use una cuchilla para eliminar el cerebelo y los bulbos olfativos, que se encuentran respectivamente en las porciones caudal y rostral del cerebro. Estos se pueden identificar por las grandes fisuras, que los separan de la corteza.
- Monta el bloque cerebral en la bandeja del vibratomo con superpegamento. Llene la bandeja de vibratome con una solución de corte helada.
- Corte secciones de tejido en el plano coronal con un grosor de 300 μm. Por lo general, se pueden recolectar 6 cortes coronales del hipocampo.
- Después de cortar cada sección, transfiera inmediatamente las lonchas al vaso de precipitados que contiene rebanadas calentado a 32-34 °C. Mantenga las secciones a esta temperatura durante 20 minutos antes de retirar el vaso de precipitados que contiene las secciones y colóquelo a temperatura ambiente durante al menos 20-30 minutos antes de grabar.
>2. Medición de la dinámica de K+ evocada eléctricamente
- Configuración de la preparación de la loncha
- Coloque suavemente la rodaja de cerebro en la bañera con una pipeta Pasteur y manténgala suavemente en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nylon.
- Asegúrese de que las puntas del electrodo estimulador bipolar estén paralelas entre sí y estén niveladas con el plano de la corte. Lentamente, en el transcurso de 6-7 segundos, inserte los electrodos en el estrato radial CA3 de aproximadamente 40-50 μm de profundidad para estimular las colaterales de Schaffer. En las secciones coronales, CA3 se puede identificar aproximadamente como la porción del hipocampo propiamente dicha lateral a la capa de células granulosas en el género del hipocampo, con el estrato radial cayendo medial y ventral a la capa de células piramidales.
- Inserte con cuidado el electrodo selectivo de K+ en el estrato radiado CA1 de aproximadamente 50 μm de profundidad, bajando lentamente el electrodo durante aproximadamente 3-4 segundos. Permita que el potencial se estabilice a través del electrodo antes de aplicar estimulaciones a la rebanada: esto suele tardar de 5 a 10 minutos. Si el corte presenta cambios espontáneos en el K+ extracelular, deséchelo y repita este proceso con un nuevo corte.
- Medir la liberación de K+ evocada
- Aplique trenes de estimulación eléctrica (8 pulsos) presionando manualmente el gatillo del estimulador mientras registra digitalmente las respuestas. Aplique la estimulación a 10 Hz y 1 ms de ancho de pulso, comenzando con una amplitud de estímulo de 10 μA.
- Aplique amplitudes de estimulación crecientes en un factor de 2 hasta que se detecte una amplitud de respuesta máxima de K+. Si no ve ninguna respuesta, acerque la posición del electrodo de K+ al sitio de estimulación en incrementos de 100 μm
- Determine la amplitud del estímulo que produce la respuesta media máxima. En nuestra experiencia, esto está entre 40 y 160 μA, dependiendo de la calidad de la preparación, la edad del animal y la distancia entre los electrodos de estimulación y el electrodo selectivo K+.
- En el mismo corte, utilizando una amplitud de estímulo en un paso inferior a la amplitud que produce la respuesta media máxima (por ejemplo, si 80 μA produce una respuesta semimáxima, utilice 40 μA) aplique trenes de estímulos de un número creciente de pulsos. Inicialmente, hemos utilizado trenes de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128 pulsos.
- Para confirmar que las señales de K+ están mediadas por el disparo del potencial de acción del baño de colaterales Schaffer estimulado eléctricamente, aplique 0,5 μM de tetrodotoxina (TTX) en ACSF durante 10 minutos y repita el protocolo de estimulación. No se deben observar respuestas evocadas.
- Después de finalizar el experimento de corte, confirme que el electrodo ha mantenido su capacidad de respuesta recalibrando el electrodo en las soluciones de calibración y asegurándose de que la respuesta no se haya desviado en más del 10% de la calibración inicial