$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
NOTA: Las grabaciones de Q175 de tipo salvaje (WT) y heterocigotos (HETs) se pueden realizar a cualquier edad y sexo. Aquí estudiamos hombres y mujeres a una edad de 51 a 76 semanas.
1. Inyección del sensor de glutamato iGluu para la expresión en axones corticoestriatales
- Utilice el extractor de pipetas (modo de un solo paso) para preparar pipetas de vidrio de borosilicato para la inyección del virus. Después de tirar, rompa la pipeta manualmente para obtener un diámetro de punta de 30-50 μm. Esterilizar en autoclave la pipeta y los instrumentos quirúrgicos, incluido el taladro para abrir el cráneo.
- Almacene el virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) a -80 °C en alícuotas de 10 μL. Si las inyecciones se realizan poco después de la producción del virus (dentro de los 6 meses), manténgalas a 5 °C. Antes de la cirugía, saque el vial y manténgalo a temperatura ambiente.
- Llene la pipeta de vidrio y elimine las burbujas.
- Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de una solución que contenga 87,5 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilacina. Inyecte bupivacaína al 0,25% por vía subcutánea (8 mg/kg) para un alivio adicional del dolor. Verifique la profundidad de la anestesia monitoreando el tono muscular y observando la ausencia de reflejos inducidos por el dolor.
- Afeitar la piel de la cabeza y esterilizarla con alcohol al 70%. Coloque el ratón en el marco estereotáxico.
- Use un bisturí para quitar la piel y un taladro de alta velocidad (38,000 rpm) para hacer un agujero de 1.2 mm en el hueso por encima de la corteza motora.
- Monte la jeringa con la pipeta de inyección adjunta en el soporte de un manipulador de precisión. Inserte la pipeta orientada verticalmente en la corteza en 4 sitios diferentes. Las coordenadas de inyección son, con respecto al bregma (en mm): anterior 1,5, lateral 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. La profundidad con respecto a la duramadre es (en mm): 1,5-1,7.
- Utilizando el sistema de inyección, inyecte 0,3 μL por sitio de la solución viral sin diluir con una velocidad de 0,05 μL/min. Después de cada inyección, deje la pipeta en su lugar durante 1 minuto antes de retirarla lentamente (1 mm/min).
- Termina cerrando la herida quirúrgica con una sutura de nylon.
- Deje el ratón de 0,5 a 1 h sobre una almohadilla térmica en una jaula limpia antes de devolverlo a su jaula original.
- Mantenga el ratón en un ciclo día-noche de 12 horas durante 6 a 8 semanas antes de la preparación de cortes de cerebro agudos.
nota: Para evitar reacciones inmunitarias que provoquen daño celular y pérdida de sinapsis, la inyección de múltiples construcciones virales debe realizarse simultáneamente o dentro de las 2-3 horas posteriores a la inyección primaria. Las coordenadas para la inyección de iGluu se seleccionaron de acuerdo con el atlas cerebral de Paxinos y Franklin. Corresponden a la corteza motora M1. La inmunotinción de los cerebros inyectados visualizó numerosos axones, pero en su mayoría bien aislados, y varices axónicas en el cuerpo estriado ipsi y contralateral y en las cortezas contralaterales M1 y S1.
>2. Búsqueda de terminales glutamatérgicos que expresen el sensor de glutamato iGluu
- Modo de calibración
- Prepare la cámara sCMOS y el software de control de la cámara con los siguientes ajustes. En la página Lectura, establezca Velocidad de lectura de píxeles: 560 MHz (= lectura más rápida), Sensibilidad/Rango dinámico: bit, Filtro de ruido espurio: Sí, Lectura de superposición: Sí. En la página Agrupación/ROI, seleccione Pantalla completa.
- Prepare un portaobjetos de vidrio que contenga una gota de 5 mg/mL de Lucifer Yellow (LY) debajo de un cubreobjetos.
- Coloque la diapositiva LY debajo de un objetivo de 63x, abra el obturador láser y realice una adquisición en serie utilizando los siguientes ajustes: Agrupamiento de píxeles: 1x1, Modo de disparo: Interno, Tiempo de exposición: Mínimo (por determinar).
- Ajuste la potencia del láser para producir un punto de fluorescencia de 4 μm de diámetro (la imagen no debe contener píxeles saturados).
- Para realizar una calibración del sistema de posicionamiento láser, seleccione los siguientes ajustes en el software de posicionamiento láser: Diámetro del tamaño del punto: 10, Velocidad de escaneo: 43.200 kHz. Haga clic en el botón Iniciar adquisición de imágenes en el panel derecho. Establezca Ejecuciones: 0, Retraso de ejecución: 0 y seleccione la opción Ejecutar en TTL en la página Secuencia. Haga clic en el botón Calibrar en la página Calibración y calibre el software de control láser de acuerdo con las instrucciones que se muestran en la esquina superior izquierda de la pantalla de adquisición.
- Si la configuración utiliza software independiente para el control de la cámara y el láser, adquiera capturas de pantalla de la ventana de adquisición de la cámara y envíelas al software de control láser para un nuevo cálculo de las coordenadas XY. Si el software está instalado en diferentes computadoras, use un capturador de video para importar la imagen al software de control láser. El software de control láser necesitará la información sobre los factores de escala XY y los desplazamientos. Para ello, determine las coordenadas de las esquinas superior izquierda, inferior izquierda e inferior derecha de la imagen dentro de la ventana de adquisición del programa de control láser. Calcule los factores de escala de acuerdo con las siguientes ecuaciones: Factor X = (X abajo a la derecha – X abajo a la izquierda)/2048, X desplazamiento = X abajo a la izquierda, Factor Y = (Y arriba a la izquierda – Y abajo a la izquierda)/2048, Y desplazamiento = Y abajo a la izquierda.
- Al final del procedimiento de calibración, cree una región rectangular de interés (ROI) de 267x460 píxeles, muévala al centro de la pantalla y haga clic en el botón Iniciar secuencia.
- Regrese a los siguientes ajustes del software de control de la cámara: Agrupación: 2x2, Modo de disparo: Exposición externa, Tiempo de exposición: Mínimo (por determinar).
- Modo de corrección de autofluorescencia
NOTA: El nivel de reposo de [Glu] en el entorno de los terminales sinápticos activos suele estar por debajo de 100 nM. En consecuencia, cualquier sensor de glutamato, especialmente un sensor de baja afinidad como iGluu, será bastante tenue en ausencia de liberación sináptica de glutamato. Sin embargo, algunas fluorescencias de iGluu pueden detectarse incluso en reposo, pero deben distinguirse de la autofluorescencia tisular. La iluminación de 473 nm provoca tanto la fluorescencia iGluu como la autofluorescencia (Figura 1A-C). Este último ocupa una amplia gama de longitudes de onda, mientras que la fluorescencia de iGluu está limitada a 480-580 nm (con un máximo de 510 nm). La corrección de la autofluorescencia se basa en la adquisición de dos imágenes con diferentes filtros de paso alto.
- Prepare los cortes de cerebro con anticipación como se describe en otra parte. Mantenga listas las rodajas de salvado.
- Transfiera los cortes a la cámara de registro, sumergiéndolos en líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (ACSF) que contiene 125 mM de cloruro de sodio (NaCl), 3 mM de cloruro de potasio (KCl), 1,25 mM de fosfato de hidrógeno y sodio (NaH2PO4), 25 mM de bicarbonato de sodio (NaHCO3), 2 mM de cloruro de calcio (CaCl2), 1 mM de cloruro de magnesio (MgCl2), 10 mM de glucosa (pH 7,3, 303 mOsm/L), suplementada con 0,5 mM de piruvato de sodio, 2,8 mM de ascorbato de sodio y 0,005 mM de glutatión. Utilice un caudal de 1 a 2 mL/min. Mantenga la temperatura del baño entre 28 y 30 °C.
- Localice el cuerpo estriado dorsal debajo de un objetivo de inmersión en agua de 20x. Fije las rodajas con una rejilla de nailon en un arpa de platino para minimizar el movimiento del tejido. Cambie al objetivo de inmersión en agua 63x /NA 1.0. Seleccione filtros que reflejan la luz a 473 nm (espejo dicroico) y la luz que pasa con longitudes de onda >510 nm (filtro de emisión).
- Sincronice la iluminación, la estimulación y la adquisición de imágenes mediante una tarjeta de analógico a digital (AD)/digital a analógico (DA) (AD/DA) con el software de control correspondiente. Configure el programa de disparo para controlar la adquisición con un tiempo de exposición láser de 180 ms y un tiempo de adquisición de imágenes de 160 ms. Utilice el dispositivo de posicionamiento láser para enviar el rayo láser a un número predeterminado de puntos y definir los ajustes de Velocidad de escaneo y Tamaño de punto.
- Adquiera una imagen de las estructuras de autofluorescencia e iGluu-positive utilizando un filtro de paso alto a 510 nm ("imagen amarilla").
- Adquiera una imagen con autofluorescencia sola utilizando un filtro de paso alto a 600 nm ("imagen roja").
- Escale las imágenes rojas y amarillas, utilizando las intensidades medias de los 10 píxeles más brillantes y los 10 más oscuros para definir el rango. Realice una resta de "imagen amarilla menos roja" y cambie la escala de la imagen sustraída para generar un archivo tif estándar de 8 bits para una visualización conveniente del botón de interés (Figura 1D). Contiene los píxeles brillantes de las estructurasiGlu u-positive, los píxeles grises del fondo y los píxeles oscuros de las estructuras con autofluorescencia.
nota: Con el equipo dado, la fluorescencia media en reposo (F) estará por debajo de 700 U.A.
- Modo de búsqueda de botones
NOTA: Los píxelesu-positivos de iGlu pueden pertenecer a elementos funcionalmente diferentes del árbol axonal, como ramas de axones de diferente orden, sitios de bifurcación, várices después del agotamiento de vesículas o várices completamente activas. Sin embargo, es casi imposible identificar los terminales sinápticos funcionales simplemente mediante una inspección visual. Por lo tanto, cada terminal sináptico glutamatérgico necesita ser identificado por su capacidad de respuesta a la despolarización eléctrica. Los sitios que no responden a la estimulación deben descartarse. El medio fisiológico para inducir la liberación de glutamato de los axones corticoestriatales es provocar un potencial de acción. Esto puede lograrse mediante el uso de un canal de rodopsina de características espectrales apropiadas o mediante la estimulación eléctrica de un axón visualizado por el propio iGluu. Para evitar la activación accidental de la opsina, preferimos este último paso
- Utilice el extractor de micropipetas (en un modo de cuatro pasos) para producir pipetas de estimulación a partir de capilares de vidrio de borosilicato. El diámetro interno de la punta debe ser de aproximadamente 1 μm. Cuando se llena con ACSF, la resistencia del electrodo debe ser de aproximadamente 10 MΩ.
- Para inducir la liberación de glutamato dependiente del potencial de acción de un conjunto de botones sinápticos unidos al mismo axón, utilice un aumento de 63x, el filtro de emisión de 510 nm y la imagen sustraída para colocar un electrodo de estimulación de vidrio junto a una varicosa fluorescente. Evite la proximidad de axones adicionales.
- Encienda el estimulador para suministrar pulsos de corriente despolarizante a la pipeta de estimulación. Utilice intensidades de corriente alrededor de 2 μA (no más de 10 μA).
- Encienda el sistema de aplicación de baño multicanal donde un canal entrega la solución de baño estándar y los otros canales entregan los bloqueadores necesarios de canales iónicos, transportadores o receptores de membrana. Controle el flujo en el sitio de registro y luego cambie al canal de tetrodotoxina (TTX) (solución de baño más 1 μM TTX). Después de 2-3 minutos, estimule el botón de interés nuevamente, pero ahora en ausencia de generación de potencial de acción. La liberación se debe directamente a la afluencia de calcio a través de los canales de calcio dependientes del voltaje.
- Al girar la tecla de intensidad en el estimulador, ajuste la corriente de estimulación para obtener respuestas similares a las provocadas a través de los potenciales de acción. Normalmente, la corriente de estimulación sería de alrededor de 6 μA para una despolarización de 0,5 ms.
- Para pruebas básicas de la preparación, aplique 0,5 mM de CdCl2. La presencia de este bloqueador de los canales de calcio, la liberación de glutamato, impide completamente la liberación sináptica de glutamato, validando así la dependencia del calcio de la señal de glutamato directamente evocada.
nota: La siguiente recomendación general puede ayudar a aumentar la tasa de éxito de los experimentos de sinapsis única en el cuerpo estriado. Para seleccionar terminales sinápticos glutamatérgicos con maquinaria de liberación intacta, una varicosidad debe: (i) Tener una forma lisa similar a un huso; (ii) No estar asociado a una bifurcación axonal; (iii) Ser más brillante que otras estructuras en la "imagen amarilla"; (iv) Residen en el neuropilo estriado en lugar de en los tractos de fibras; (v) Residen en una rama axonal muy delgada; (vi) No residir dentro de las partes más profundas de la rebanada.
>3. Visualización de la liberación y eliminación de glutamato
- Modo de grabación
NOTA: Después de la sustracción de la autofluorescencia (paso 2.2) y algunas pruebas iniciales de respuesta del botón de interés (paso 2.3), puede comenzar la adquisición de datos. Las respuestas a la activación eléctrica de la liberación de glutamato desde terminales de un solo axón se pueden observar directamente en la imagen (Figura 2), sin necesidad de aplicar más herramientas de análisis. Sin embargo, resultó muy conveniente extraer inmediatamente algunos indicadores básicos del rendimiento de la sinapsis (Figura 3). Esta información es necesaria para tomar decisiones sobre el curso posterior del experimento, como la selección de tipos terminales particulares, la evaluación rápida de las alteraciones relacionadas con la EH, el número y la frecuencia de los ensayos o fármacos que se aplicarán con el sistema de superfusión. También puede ser necesario lidiar con los artefactos que eventualmente aparecen. En primer lugar, se describen los ajustes estándar para el registro de datos.
- Con los accionamientos XY del microscopio, coloque el botón iGluu-positivo probado cerca del centro del campo de visión. Detenga la adquisición de imágenes con el botón Anular adquisición. En la última imagen adquirida, determine la posición XY del centro del botón en reposo haciendo clic sobre él con el botón izquierdo del ratón. Las coordenadas XY del cursor establecido se mostrarán en el panel de estado inferior de la ventana de adquisición.
- Utilizando los datos de calibración (paso 2.1.6), calcule las coordenadas del sitio donde se debe enviar el rayo láser para la excitación de la fluorescencia iGluu. Utilice las siguientes ecuaciones: Láser X = X cámara * Factor X + X desplazamiento, Y láser = Y desplazamiento – Cámara Y * Factor Y. Al realizar este recálculo, preste atención a la configuración de volteo vertical u horizontal de la cámara.
- Cree una secuencia de un punto en el software de control láser utilizando las coordenadas calculadas. Para este propósito, seleccione Punto en el cuadro Agregar a secuencia en la página Secuencia del software de control láser. Seleccione 10 μs para el retardo de inicio de activación y 180 ms para el tiempo de pulso láser. Mueva el ratón a las coordenadas calculadas y haga clic con el botón izquierdo.
- Seleccione los siguientes ajustes en el software de control láser: Carreras: 0, Retardo de ejecución: 0, Secuencia: Ejecución en TTL. A continuación, haga clic en Iniciar secuencia.
- En el software de control de la cámara, seleccione los siguientes ajustes: En la página Agrupación/ROI, establezca Área de imagen: Personalizada, Agrupación de píxeles: 2x2, Altura: 20, Anchura: 20, Izquierda: Coordenada X del puntou-positivo de iGlu en reposo menos 10 px, Abajo: Coordenada Y del puntou-positivo de iGlu en reposo menos 10 px, Modo de adquisición: Serie cinética, Longitud de la serie cinética: 400, tiempo de exposición: 0.0003744s (valor mínimo). Con estos ajustes, la velocidad de adquisición será de 2,48 kHz.
- Seleccione Modo de activación: Externo. Haga clic en Tomar señal en el software de control de la cámara. Iniciar el protocolo experimental establecido para el dispositivo de activación.
- Implemente el protocolo experimental Trial con la siguiente línea de tiempo: 0 ms – inicio de la prueba, 1 ms – inicio de la iluminación láser, 20 ms – inicio de la adquisición de imágenes con la cámara, 70 ms – inicio de la estimulación eléctrica 1, 120 – inicio de la estimulación eléctrica 2, 181 ms – fin de la prueba (láser y cámara apagados). Así, durante una prueba la cámara adquiere 400 fotogramas con una frecuencia de 2,48 kHz. Véanse los pasos 2.3.3 y 2.3.5. para obtener más información sobre la estimulación eléctrica.
- Para permitir una recuperación suficiente de los grupos de vesículas presinápticas, aplique el protocolo Trial con una frecuencia de repetición de 0,1 Hz o inferior.
- Construcción fuera de línea del transitorio de glutamato y evaluación rápida de la liberación y el aclaramiento de glutamato para la identificación de sinapsis patológicas
- Activar las rutinas de evaluación. Aquí, utilizamos un software escrito internamente SynBout v. 3.2. (autor: Anton Dvorzhak). Los siguientes pasos son necesarios para construir un transitorio ΔF/F a partir de los píxeles con fluorescencia iGluu elevada, como en el video de la Figura 2.
- Para determinar el tamaño del botón, se calculó la media y la desviación estándar (DE) de la intensidad de fluorescencia del ROI en reposo (F), antes del inicio de la estimulación. Determine y encuadre el área ocupada por píxeles con >F media + 3 SD + 3 SD (Figura 3A). Determine un diámetro virtual (en μm) asumiendo una forma circular del área supraumbral.
- Determine ΔF como la diferencia entre el valor de intensidad máxima y F. Trace la corriente de estimulación y ΔF/F en función del tiempo (Figura 3B). Calcular la SD de ΔF/F en reposo (antes del inicio de la estimulación) y la "Amplitud máxima". Utilice píxeles con amplitud de pico superior a 3 SD de ΔF/F para realizar un ajuste monoexponencial para el decaimiento desde el pico. Determine la constante de tiempo de decaimiento TauD de ΔF/F.
- Para estimar la "Amplitud máxima" en una sinapsis determinada, seleccione el píxel con el valor más alto de ΔF/F. Por lo general, se encuentra dentro o junto a los límites de la fluorescencia del botón en reposo. La "amplitud máxima" sería el mejor indicador de la carga de glutamato presentada a la maquinaria de eliminación de una sola sinapsis.
