Registros electrofisiológicos in vivo de actividades cerebrales de múltiples sitios en ratas

Resumen

Fuente: Haumesser, J. K., et al. Este video muestra el procedimiento detallado para preparar a una rata anestesiada para registros electrofisiológicos de la actividad cerebral desde múltiples sitios. Se disecciona el cuero cabelludo para acceder al cráneo y se perforan agujeros en lugares precisos para instalar y asegurar los electrodos. A continuación, se insertan electrodos de microhilo de tungsteno en la ubicación objetivo para registrar los datos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Cirugía

1. Para registros electrofisiológicos, use uretano (PRECAUCIÓN) para la anestesia.
   cautela: El uretano es tóxico y cancerígeno, por lo que siempre se adhiere a las normas de seguridad y a la hoja de datos proporcionada por el fabricante de la sustancia.
2. Prepare una solución de 200 mg/ml de uretano en una solución salina médica de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9%.
3. Administrar un total de 1,3 g/kg de uretano de peso corporal por vía intraperitoneal (IP). Dependiendo de la cepa de rata, podría ser razonable dividir la dosis en dos dosis con un intervalo de 15 minutos entre las inyecciones para mejorar la seguridad de la anestesia.
4. Compruebe la profundidad de la anestesia utilizando el reflejo de retirada del pedal y otros reflejos adecuados. Si la anestesia no es lo suficientemente profunda para realizar la cirugía, inyecte 0,15 g/kg de peso corporal de uretano IP y espere otros 15 minutos.
5. Aplícate un ungüento para los ojos para prevenir la deshidratación de la córnea.
6. Controle constantemente la frecuencia respiratoria y el reflejo de retirada del pedal durante la anestesia. Use una almohadilla térmica para animales pequeños con control de temperatura para asegurarse de que se mantenga una temperatura corporal fisiológica durante toda la cirugía. Antes de iniciar los registros electrofisiológicos, cambie a una alternativa no eléctrica (por ejemplo, almohadilla para la cabeza de acetato de sodio).
7. Afeita el pelaje a lo largo de la parte dorsal de la cabeza para lograr un campo quirúrgico limpio. Desinfecte alrededor del sitio de la incisión con un desinfectante quirúrgico adecuado. Fija al animal en el marco estereotáctico.
8. Realizar una incisión de 2 cm de largo en el cuero cabelludo en dirección sagital con un bisturí. Use un bisturí para raspar ligeramente la aponeurosis del cráneo y desinfectar el cráneo. Use bastoncillos de algodón empapados en peróxido de hidrógeno al 3% (H₂O₂) para eliminar cualquier tejido restante.
9. Use un electrocauter o termocauter para controlar el sangrado, si es necesario. Detenga las hemorragias del hueso del cráneo y del hipodermo, si la hemorragia no se detiene espontáneamente después de 1-2 minutos y dificulta la visión del cráneo.
10. Ajuste la barra de incisivos hasta que la cabeza se coloque en posición de cráneo plano, lo que significa que el bregma y la lambda como puntos de referencia estereotáxicos están en el mismo plano. Esto es lo más importante para lograr una alta precisión quirúrgica. Utilice una herramienta estándar de alineación estereotáxica de ratas, calibre la punta designada para el bregma bajo visión microscópica y ajuste la barra de incisivos hasta que los puntos designados para el bregma y la lambda en la herramienta toquen el cráneo al mismo tiempo><. nota: Una vista desde un lado con luz enfocada desde el otro puede ayudar a determinar esta condición. Alternativamente, tome un soporte estereotáxico con una cánula fina y mida las coordenadas dorsoventrales de Bregma y lambda bajo visión microscópica. Ajuste la barra de incisivos hasta que las coordenadas dorsoventrales de Bregma y lambda sean las mismas.
11. Use un soporte estereotáxico con una cánula, calibre según el bregma y luego calcule la posición de todos los orificios perforados en el cráneo. Con el soporte estereotáxico, marque las posiciones de los orificios que se van a perforar, ya sea rascando cuidadosamente el cráneo o usando un marcador de color quirúrgico. Las coordenadas para esto dependen de los objetivos; En la Tabla 1 se indican las coordenadas con referencia al bregma para la vía hiperdirecta, incluidas las coordenadas sugeridas para los electrodos de referencia cerebelosos.
12. Con un microtaladro, taladre con cuidado todos los agujeros. Para el núcleo subtalámico (STN) y la sustancia negra pars reticulada (SNr), perfore un orificio común (de aproximadamente 2 mm x 3 mm de tamaño). Todos los demás orificios deben tener un diámetro de aproximadamente 1 mm.
13. Tome dos cánulas finas (al menos 27 G) y doble sus puntas para formar una forma ganchuda, usando una superficie dura o pinzas. Utilícelos para eliminar cualquier residuo de los orificios de perforación y corte y retire con cuidado la duramadre en el orificio STN / SNr común.
14. Enjuague los orificios de perforación con solución salina fisiológica. Aplique una gota de solución salina fisiológica cada 15 minutos en los orificios de perforación para evitar que el cerebro y la duramadre se sequen.
15. Tome un microtaladro y un microtornillo de acero inoxidable correspondiente (por ejemplo, un tornillo M de 1,2 mm x 2 mm), taladre un orificio y atornille un microtornillo entre los orificios de perforación de los electrodos epidurales de referencia por encima del cerebelo, haga lo mismo con los electrodos epidurales M1.
16. Deslice los electrodos epidurales de Ag/AgCl de fabricación propia en los orificios de perforación para los electrodos de referencia y los electrodos M1. Guíe la punta del electrodo con pinzas finas y deslícela directamente debajo del hueso del cráneo en el orificio de perforación.
17. Fije todos los electrodos epidurales con acrílico dental de dos componentes. Asegúrese de no cubrir el punto bregma ni afectar el orificio STN/SNr común.
18. Inserte el soporte preparado con los electrodos de microhilo de tungsteno en el marco estereotáxico.
19. Calibrar el electrodo más ventral, que está destinado a dirigirse al STN, al bregma. Ajústelo a la posición calculada por encima del orificio STN/SNr común y baje los electrodos hasta el cerebro bajo visión microscópica. Asegúrese de que los electrodos de microalambre de tungsteno entren suavemente en el cerebro.

>2. Mapeo electrofisiológico y registros

NOTA: Para este paso, es necesaria una jaula de Faraday y un sistema de registro electrofisiológico multicanal con software de registro capaz de filtrar y clasificar picos en línea. Preferiblemente, use un sistema que funcione con un preamplificador colocado cerca de la cabeza de los animales para mantener el ruido eléctrico y los artefactos al mínimo absoluto. Además de los electrodos de microhilo de tungsteno, se necesitan al menos un electrodo epidural y un electrodo de referencia para realizar registros de la vía hiperdirecta. Se recomienda insertar los electrodos epidurales y de referencia por pares sin que se toquen entre sí, esto ayuda en caso de mal funcionamiento y permite diferentes tipos de referencia en el análisis de datos.

1. Coloque una jaula de Faraday móvil sobre el marco estereotáxico. Si solo se dispone de una jaula de Faraday estacionaria, mueva con cuidado el marco estereotáxico a la jaula de Faraday mientras se asegura de que los electrodos cerebrales profundos no se introduzcan en el cerebro hasta que el marco estereotáxico esté en su posición final.
2. Conecte los electrodos a la cabecera de la configuración electrofisiológica. Asegúrese de que los electrodos de referencia estén conectados a los canales de referencia adecuados.
3. Configure el software de grabación: filtro de paso de banda (0,05-8.000 Hz) y amplifique (gane 1.500-2.000x) la señal de datos sin procesar. Utilice un filtro de picos y LFP en línea con los ajustes adecuados (filtro de paso de banda de 0,05-250 Hz para LFP, filtro de paso de banda de 300-8.000 Hz para MUA). Para todos los filtros, use un filtro tipo mantequilla.
4. Configure un umbral de pico, si corresponde, para la clasificación de picos en línea. La mayoría de los programas de grabación permiten establecer un umbral de pico, que es un valor de amplitud por encima del cual el software marca una señal como un pico. Este umbral puede determinarse matemáticamente como un factor o una desviación estándar de la amplitud media de la señal de pico filtrada, o puede determinarse preferiblemente mediante inspección visual de segmentos de datos <500 ms y configurarse como una línea por encima del ruido de la señal en una interfaz gráfica de usuario.
   nota: La intención al establecer un umbral de picos es contar los picos y clasificar las unidades para proporcionar información sobre cuántas neuronas se registran actualmente y cómo se forman sus picos.
5. Baje lentamente los electrodos de microcable de tungsteno a 1 mm dorsal del objetivo, que es STN para vía hiperdirecta. Espere a que la señal se estabilice si es necesario.
6. Para el mapeo electrofisiológico, avance los electrodos ventralmente en pasos de 100 μm. En cada paso, evalúe el patrón de disparo, la velocidad de disparo y la forma de los picos. Compare estos con los ejemplos típicos que se dan en la Figura 1. Comúnmente, los núcleos densos muestran picos rápidos y continuos en varios pasos dorsoventrales, mientras que las estructuras ricas en fibras muestran bajas tasas de disparo y una actividad de picos menos homogénea en los pasos ventrales posteriores.
7. Para la vía hiperdirecta, asegúrese de que el electrodo más ventral esté dentro de STN.
   nota: El STN se alcanza cuando se detecta un aumento considerable de MUA ventral de la Zona incerta. Ventral al STN, el pico se detiene casi por completo porque el electrodo ha alcanzado la cápsula interna. Cuando el electrodo más ventral está en STN, la configuración de los microelectrodos de tungsteno asegura que el segundo electrodo posterior esté en SNr. Podría ser necesario un ajuste fino dorsoventral en pequeños incrementos para registrar MUA típico en STN y SNr al mismo tiempo. Hay que tener en cuenta que la frecuencia de MUA depende del número de neuronas realmente registradas y del nivel de activación cerebral.
8. Una vez que los electrodos estén en las estructuras deseadas, configure el filtrado en línea y la clasificación de picos (consulte la Figura 2) y, a continuación, inicie el registro de los datos. En la Figura 3 se muestran ejemplos típicos de los diferentes estados de sincronización cortical que se pueden identificar en los registros de LFP.

Tabla 1: Coordenadas estereotáxicas para el registro de la vía hiperdirecta de los ganglios cortico-basales. Todos los puntos se miden desde el punto de referencia del bregma en el cráneo en mm; N.A.- No aplica.

Coordenadas desde Bregma	Stn	Snr	M1	Referencia 1	Referencia 2
Antero-posterior	-3.6	-4,8	+3.0	-10.0	-10.0
medial-lateral	+2.5	+2.5	+3.0	+3.0	-3.0
dorsal-ventral	-8.0	N. D.	N. D.	N. D.	N. D.

Resultados

Figura 1: Actividad característica de múltiples unidades de una trayectoria de electrodo dorsoventral dirigida al STN. (A) Registros de unidades múltiples del núcleo talámico posteromedial ventral (VPM), la zona incerta (ZI), el núcleo subtalámico (STN) y la sustancia negra pars reticularis (SNr). El VPM exhibe picos de alta amplitud escasos e irregularmente espaciados. Este patrón de picos cesa al a...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Electrodos epidurales personalizados Ag/AgCl	Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Alemania info@goodfellow.com	ID del producto AG005127 para alambre de plata al 99,99 %	Los electrodos de Ag/AgCl permitirán una mejor calidad de la señal, pero solo se pueden usar en experimentos agudos. Posible sustitución: Electrodos de acero inoxidable
Soporte estereotáxico con bloque acrílico	David Kopf Instrumentos, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, Estados Unidos	ID del producto Modelo 1770 Portaelectrodos estándar	Asegúrese de que el bloque acrílico tenga huecos que se adapten a la configuración del electrodo para el objetivo deseado. Los bloques acrílicos se pueden modificar fácilmente con un archivo para obtener la configuración deseada. Posible sustitución: Portaelectrodos de construcción propia
Electrodos de microhilo de tungsteno de 1,5 MΩ de impedancia	Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 Estados Unidos	ID del producto: WE3ST31.5A5-250um	Los 1,5 MΩ son necesarios para registrar MUA y LFP al mismo tiempo. Posible sustitución: Se pueden utilizar microelectrodos de diferentes materiales. Los electrodos deben ser rectos, robustos y lo más finos posible.
Herramienta de alineación de ratas	David Kopf Instrumentos, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, Estados Unidos	ID del producto Modelo 944 Herramienta de alineación de ratas	Permite que la orientación exacta del cerebro coincida con los atlas estereotáxicos. Posible sustitución: Soporte estereotáxico con cánula
Acrílico dental de dos componentes	Productos Dentales Asociados Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, Reino Unido	Simplex Rapid Powder Clear 225g, Código de producto: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Código de producto: ACR920	Dependiendo de los electrodos utilizados, el superpegamento puede ser una alternativa fácil, si los electrodos son pequeños y livianos. Posible reemplazo: Superglue (a base de cianacrilato)
Jaula de Faraday	Autoconstrucción		Una jaula de Faraday adecuada será la mejor protección contra los artefactos electromagnéticos, pero todo lo que se pueda formar en forma de caja o aplicar a un marco y esté hecho de material conductor puede ayudar. Posible reemplazo: Papel de aluminio o malla de cobre
Configuración electrofisiológica con software de registro y capacidades de clasificación de picos en línea	Sistema de adquisición de datos neuronales OmniPlex® Plexón Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 Estados Unidos		El software de clasificación fuera de línea es una alternativa potencial, se pueden encontrar múltiples scripts y softwares de forma gratuita en la comunidad de código abierto.