Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
>1. Preparación diaria de aparatos experimentales
- Encienda el amplificador, la computadora y el sistema de cámara, y verifique que el software se esté ejecutando.
- Coloque líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, por sus siglas en inglés) en un tubo de 50 ml y burbujee con carbeno.
- Utilice una bomba peristáltica para hacer circular el ACSF. Ajuste el caudal a aproximadamente 1 mL/min.
- Ajuste la altura de la pipeta de succión para que el nivel de líquido dentro de la cámara del experimento sea siempre constante.
nota: El nivel de la solución es importante para obtener un registro estable, por lo tanto, el ajuste debe realizarse utilizando un micromanipulador.
- Instale el electrodo de tierra compuesto por viruta amarilla rellena con agar KCl 3 M (2%) en un soporte con un alambre Ag-AgCl con una pequeña cantidad de solución de KCl 3 M.
- Llene una pequeña cantidad de ACSF (aproximadamente dos tercios del volumen) en el electrodo de vidrio (1 mm de diámetro exterior, 0,78 mm de diámetro interior tirado con un extractor de micropipetas) con una punta amarilla de tubo delgado y cónico y colóquelo en el soporte de electrodos.
- Fije el soporte a la varilla instalada en el manipulador. Con un amplificador, asegúrese de que la resistencia del electrodo sea de aproximadamente 1 MΩ.
nota: El electrodo de tipo parche de vástago largo y apertura ancha (apertura de 4-8 μm) debe ser bueno para la grabación de campo y como electrodo estimulante.
>2. Iniciar una sesión de grabación
- Tome una preparación de rodajas de la cámara húmeda con pinzas.
- Coloque rápidamente el corte en una cámara experimental bajo el microscopio (Figura 1).
- Empuje el borde del anillo firmemente en la junta tórica de silicona. Tenga cuidado de no romper la membrana o el fondo de la cámara del experimento.
nota: La dirección del corte debe tenerse en cuenta con respecto a la dirección de los electrodos de estimulación y registro en el campo de visión. La rebanada sana debe adherirse al filtro de membrana, por lo que no es necesario utilizar otros dispositivos para fijar las rebanadas, como pesas y mallas de nailon.
- Coloque la punta del electrodo estimulador y el electrodo de registro de potencial de campo en el corte bajo el microscopio con luz transmitida.
- Utilice el sistema de registro electrofisiológico para comprobar la respuesta. Confirme el registro electrofisiológico habitual (no manchado) con la configuración dada.
nota: El electrodo de registro se puede omitir, pero es útil para verificar la fisiología del corte.
- Ajuste la intensidad de la luz de excitación a aproximadamente el 70-80% de la capacidad máxima de la cámara que corresponde a 13-15 mW/cm2 en la muestra cuando muestree a 10 kHz con una lente de objetivo de inmersión en agua 5x y una lente de tubo PLAN APO 1x. La longitud de onda de la luz de excitación es de 530 nm y el filtro de emisión debe ser > 590 nm.
nota: Utilice un obturador para minimizar la cantidad de luz de excitación. La exposición continua a la luz puede deteriorar la fisiología de la rebanada. El posible efecto nocivo de la luz depende de la intensidad y duración de la luz. Utilice el registro electrofisiológico para juzgar el efecto de la luz. En el caso de una resistencia de 13-15 mW/cm2, el límite superior de la tolerancia debe ser aproximadamente 1 s de exposición.
- Ajuste el enfoque con el sistema de adquisición utilizando la fuente de luz fluorescente porque el enfoque puede ser diferente según la longitud de onda e inicie la adquisición.
- Examine los datos en un software de adquisición de imágenes.
nota: Utilizamos el paquete de microprogramación original del software de análisis numérico para el análisis detallado.
