Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Animales
- Utilice ratones OR-IRES-tauGFP modificados genéticamente (OR = Receptor olfativo, IRES = Sitio de entrada del ribosoma interno, tauGFP = proteína fluorescente de verde tau) disponibles en el Laboratorio Jackson. Estos ratones fueron desarrollados en el laboratorio del Dr. Peter Mombaerts con el fin de analizar la orientación de los axones y el desarrollo del sistema olfativo. Por ejemplo, la línea MOR23-IRES-tauGFP, número de stock 006643, lleva el nombre oficial de cepa B6; 129P2-Olfr16tm2Mom/MomJ; del mismo modo, la línea SR1-IRES-tauGFP, número de stock 6717 lleva el nombre oficial B6; 129P2-Olfr124tm1Mamá/MamáJ.
- En cuanto a la edad de los animales: para un mejor resultado del protocolo, utilizar animales entre 2 y 4 semanas de edad. En este grupo de edad, la disección es más fácil (huesos más blandos, epitelio olfativo más firme) y las protuberancias dendríticas son más grandes en comparación con los animales más viejos.
>2. Preparación de electrodos y soluciones
- Para las pipetas estimulantes: compre pipetas estimulantes pre-tiradas. De lo contrario, prepárelos manualmente.
- Con una llama, doble seis pipetas de vidrio de 1 mm a aproximadamente 1 cm de la punta. Inserte estas seis pipetas más una séptima pipeta recta en un tubo termorretráctil de 1,5 cm reforzado con un ojal.
- El calor contrae el tubo para mantener los barriles unidos entre sí. Coloque un tubo termorretráctil adicional en el otro extremo de los barriles. Tire de esta pipeta estimulante con un extractor de varios barriles.
- Agregue un poco de pegamento líquido blanco alrededor del ojal para fortalecer las puntas dobladas. Deje secar durante la noche (O/N).
- Preparar 1 o 2 L de solución extracelular normal de Ringer (en mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, glucosa 15; pH 7.6 y 305 mOsm). Mantener a 4 °C hasta su uso.
- Preparar solución madre intracelular (en mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanosulfónico 30, ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) 5, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) 10, sacarosa 70; pH 7,2 (KOH) y 310 mOsm. Mantener a 4 °C hasta su uso. Bueno para varias semanas.
- Prepare la solución de registro intracelular con nistatina extemporáneamente (en el último minuto) antes del experimento.
- Pesar 3 mg de nistatina, añadir 50 μl de dimetilsulfóxido (DMSO); vórtice 20 seg y luego sonicar 2-3 min hasta que se diluya por completo.
- Añadir 20 μl de solución de DMSO-nistatina en 5 ml de solución madre intracelular. Vórtice 20 segundos, luego sonicar 3 min. Mantenga esta solución a 4 °C y protéjala de la luz directa, la nistatina es sensible a la luz. Esta solución se puede utilizar durante unas horas. Reemplace todos los días.
- Una vez que la preparación del epitelio olfativo esté bajo el microscopio, tome un poco de esta solución en una jeringa de 1 ml con una punta amarilla alargada por la llama para llenar los electrodos; proteger de la luz directa. Una vez a temperatura ambiente (RT), la solución de nistatina no es estable; Reemplace la solución en la jeringa de 1 ml cada hora o manténgala en hielo.
- Tire de los electrodos de registro con un tirador para obtener un cuello largo y una punta pequeña (~2 μm) con una resistencia de 15-20 MΩ con la solución interna de nistatina.
- Prepare la solución odorante a 0,5 M en DMSO bajo la campana extractora; alícuota y manténgala a -20 °C hasta su uso. Diluya el odorante en la solución de Ringer hasta obtener la concentración deseada. Llene la pipeta estimulante.
>3. Preparación del epitelio olfativo
>Nota: Los ratones OR-IRES-tauGFP expresan la tauGFP bajo el control del promotor OR. En estos ratones, todas las neuronas que expresan el OR de interés están marcadas con GFP. Este protocolo está adaptado para las OR expresadas en todas las zonas. Sin embargo, las disecciones y registros son más fáciles para los OR expresados en la zona dorsal.
- Anestesiar al animal inyectando una mezcla de ketamina y xilacina (150 mg/kg y 10 mg/kg de peso corporal, respectivamente). La decapitación se puede realizar con tijeras afiladas para ratones jóvenes o con una guillotina para roedores mantenida adecuadamente para ratones mayores.
- Con unas tijeras de disección de anillos, haga una incisión medial longitudinal a través de la piel dorsal. Retira la piel tirando de ella. Con las tijeras, corte los maxilares inferiores en la articulación de la mandíbula. Extraer los dientes frontales superiores mediante un corte coronal paralelo a los dientes.
- Haz un corte coronal de la cabeza detrás de los ojos y conserva solo la parte anterior de la cabeza. Sumérjalo en una solución helada de Ringer para la disección debajo del endoscopio.
- Diseccionar debajo del endoscopio: en el lado ventral, hacer un corte longitudinal a lo largo del maxilar superior/los dientes. Corta los huesos dorsales longitudinalmente, siguiendo el lado dorsolateral de la cavidad nasal. Eliminar la mayoría de los huesos y el paladar; transferir el tabique y el epitelio adherido a él en Ringer oxigenado en RT.
- Para la disección final: Justo antes de comenzar la sesión de grabación, retire el epitelio del tabique subyacente con pinzas. Separar el epitelio con pinzas y con dos cortes de tijera de 4-5 mm (utilizar tijeras micro-vannas) en la parte anterior del tabique donde la adherencia es más fuerte.
- Retire con cuidado el órgano vomeronasal cortándolo a lo largo de su conexión dorsal con el epitelio septal. Transfiera el epitelio a una cámara de registro con la capa de moco hacia arriba; Manténgalo plano en la cámara con un arpa.
- Instale la cámara debajo de un microscopio vertical equipado con óptica de fluorescencia y una cámara sensible. Visualice la preparación en la pantalla de la computadora a gran aumento a través de un objetivo de inmersión en agua de 40X (apertura numérica 0.8) y un aumento adicional de 2X o 4X logrado por una lente de aumento. Perfundir continuamente con Ringer oxigenado a RT (1-2 ml/min).
>4. Sesión de grabación
- Búsqueda de células fluorescentes: excite la preparación a 480 nm para EGFP, que emite luz en el rango de 530-550 nm; apunte a una perilla dendrítica que sea visible de manera confiable en fluorescencia y bajo campo claro.
- Llene el electrodo con una solución intracelular con nistatina; elimine las burbujas golpeando suavemente el electrodo.
- Inserte el electrodo en el soporte del electrodo, aplique presión positiva en la pipeta; La resistencia debe ser de 15-20 MΩ.
- Acerque el electrodo a la celda; una vez que la resistencia alcance ~40 MΩ, libere la presión positiva y aplique una ligera presión negativa para alcanzar un gigaseal.
- Una vez alcanzado el sellado, establezca el potencial de membrana en aproximadamente -75 mV;
- Una vez abierta la célula, se procede con protocolos de estimulación, tratamientos farmacológicos. Para medir la respuesta a una sola estimulación odorífera, registre de 200 a 500 mseg de actividad espontánea, estimule durante 500 mseg y mida la respuesta de la célula durante un máximo de 10 seg. Para tratamientos farmacológicos, perfundir los agentes farmacológicos a la concentración deseada.
