Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Alineación de la trayectoria óptica entre la cámara CMOS (semiconductor de óxido metálico complementario) y el latiguillo individual o ramificado
- Afloje todos los tornillos del traductor de 5 ejes (Figura 1B).
- Atornille el cable de conexión (Figura 1B) al adaptador [SMA (subminiatura A) o FC (conector de fibra óptica)] que está fijado al traductor de 5 ejes.
- Encienda la luz de excitación de 470 nm (Figura 1B) a baja potencia (100 μW) y coloque la punta del cable de conexión apuntando a un portaobjetos de plástico autofluorescente. Esto no tiene ninguna relación con las grabaciones futuras, sino que es únicamente para visualizar el proceso de alineación.
- Grabe desde la cámara CMOS (Figura 1B) en modo en vivo. Aumente la ganancia o ajuste la tabla de búsqueda (LUT) hasta que la imagen no esté completamente negra. El punto es poder ver una imagen en el punto focal del objetivo (Figura 1B).
- Haga avanzar el traductor de 5 ejes hacia el objetivo, asegurándose de que la luz de 470 nm esté centrada en la fibra en el extremo SMA o FC del cable de conexión hasta que se pueda resolver una imagen en la cámara.
- Ajuste los ejes X e Y hasta que la imagen esté centrada y bien resuelta.
- Visualice la luz emitida por el extremo de la férula del cable de conexión. Debe aparecer como un círculo isótropo. Si se utiliza un latiguillo ramificado, la cantidad de luz emitida en los extremos de la férula de cada latiguillo debe ser similar. Si el círculo no es isótropo o la luz emitida es desigual, ajuste el traductor de 5 ejes en el eje X-Y.
>2. Configuración de ROIs alrededor de las fibras para la medición de la intensidad fluorescente media
- Enciende todas las luces de excitación para visualizar mejor las fibras. Ajuste la ganancia de la cámara para que no haya píxeles saturados y haya una imagen clara de las fibras.
- Graba en vivo o toma una imagen preliminar.
- Dibuje los ROI alrededor de las fibras y guárdelos para medir los valores de intensidad media durante las grabaciones (Figura 1A).
- En el caso de varias grabaciones de fibra, pruebe la independencia de las señales.
- Grabación en vivo desde todas las fibras.
- Apunte una fibra hacia una fuente de luz y golpee con un dedo. Las grandes fluctuaciones deben ocurrir únicamente en ese canal (fuga aceptable 1:1000).
- Si las señales no son independientes, vuelva a dibujar ROI más conservadores y repita la prueba de independencia.
- Para etiquetar y rastrear qué ROI corresponde a qué fibra, cinta adhesiva de color o esmalte de uñas se puede aplicar al final de las fibras. Tome una foto antes del inicio de cualquier experimento como recordatorio secundario.
3. Configuración de la arena de grabación
- Cuelgue el cable de conexión sobre la arena con soportes, abrazaderas o soportes.
- Asegúrese de que el animal pueda moverse libremente por toda la arena, sin inhibiciones por la longitud de la fibra.
- Si se utiliza una caja operante o un campo abierto, asegúrese de que el cable de conexión pueda llegar al animal con una flexión mínima. Si esto requiere un pinchazo en la nariz, asegúrese de que haya suficiente espacio por encima de la cabeza para evitar que la fibra se doble. Evite doblar o torcer excesivamente el cable de conexión.
>4. Grabaciones in vivo
- Inspeccione visualmente el extremo distal de las fibras del cordón de conexión a ojo y con un microscopio de minifibra. Si la superficie de las fibras está rayada, vuelva a pulir las fibras con una película de pulido/lapeado de fibras con grano fino (1 μm y 0,3 μm).
- Limpie los extremos distales del latiguillo con etanol al 70% y un aplicador de punta de algodón.
- Limpie las cánulas de fibra óptica con etanol al 70% y un aplicador de punta de algodón.
- Conecte el extremo de la férula del cable de conexión a la fibra implantada mediante un manguito dividido de cerámica cubierto con un tubo retráctil negro. Asegúrese de que el manguito esté apretado durante la conexión. De lo contrario, utilice una nueva funda.
nota: Si hay algún espacio entre la férula del cable de conexión y el implante, habrá una gran pérdida de señal y las grabaciones no funcionarán.
- Permita que el animal se recupere durante unos minutos antes del inicio de las pruebas de comportamiento.
- Comience a grabar la señal óptica y ejecute el experimento.
- Mientras graba, vigile cuidadosamente el seguimiento en vivo para garantizar grabaciones de calidad. Se espera que la señal disminuya rápidamente en función del tiempo en los primeros 2 minutos de grabación. Este efecto es causado por el decaimiento del LED mediado por el calor, por lo que el aumento de calor aumenta la resistencia del elemento óptico.
- Si se produce un salto en la señal que excede la cinética de encendido/apagado de GCaMP, esto a menudo indica que el manguito no está lo suficientemente apretado y que el espacio entre el cable de conexión y el implante está cambiando. En este caso, detenga el experimento y vuelva a conectar al animal con una funda nueva.
