Un estudio electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Chen, X., et al. Investigaciones electrofisiológicas de la función sinapsis retinogeniculada y corticogeniculada. J. Vis. Exp. (2019).

El video describe el registro electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón. Los cortes que contienen el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) se colocan en una cámara de registro. Se coloca una pipeta estimulante en el tracto óptico para estimular las células ganglionares de la retina (RGC) e investigar las sinapsis retinogeniculadas o en el núcleo reticularis thalami para estimular las neuronas corticales e investigar las sinapsis corticogeniculadas. Tras la estimulación, las RGC y las neuronas corticales liberan neurotransmisores excitadores, que producen corrientes sinápticas en las neuronas de relevo LGN. Estas corrientes se registran utilizando una pipeta de registro de pinza de parche.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Soluciones

1. Solución de disección
   1. Para reducir la excitotoxicidad, prepare una solución a base de colina para usar durante la disección como se presenta aquí (en mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 cloruro de colina, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl₂ y 25 glucosa. Prepare la solución de disección menos de 1 semana antes del experimento.
2. Solución de grabación
   1. Prepare una solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, por sus siglas en inglés) que contenga (en mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ y 25 glucosa. Añadir 50 μM de ácido D-2-amino-5-fosfonovalérico (D-APV) y 10 μM de hidrobromuro SR 95531 (gabazina) para bloquear los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) y GABAA, respectivamente.
3. Solución intracelular
   1. Prepare una solución intracelular que contenga (en mM): 35 Cs-gluconato, 100 CsCl, 10 ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico (HEPES), 10 ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) y 0,1 D-600 (clorhidrato de metoxiverapamilo). Ajuste el pH a 7.3 con CsOH. Filtre, alícuota y almacene la solución madre a -20 °C hasta su uso.

2. Disección

1. Prepare dos cámaras de corte, de las cuales una se llena con 100 mL de la solución de disección y la otra con 100 mL de solución de registro. Coloque los dos vasos de precipitados en un baño de agua (37 °C) y burbujee las soluciones con carbógeno durante al menos 15 minutos antes de la disección.
2. Llene un vaso de plástico con 250 ml de solución de disección casi helada (pero no congelada). Burbujee con cárbogen al menos 15 minutos antes de usar.
3. Llene una placa de Petri de plástico (100 mm x 20 mm), en la que se realizará la disección cerebral, con la solución de disección fría. Coloca un pedazo de papel de filtro en la tapa de la placa de Petri.
4. Enfríe la cámara de disección del vibrótomo.
5. Anestesiar a un ratón con isoflurano al 2,5%, por ejemplo, en la jaula del ratón. Tan pronto como el ratón no responda a un pellizco de cola, decapita al ratón cerca de la médula cervical y sumerge la cabeza en la solución de disección helada en la base de la placa de Petri.
6. Corta la piel de la cabeza desde la caudal hasta la nasal y mantenla lateralmente con los dedos para exponer el cráneo. Para extirpar el prosencéfalo, primero corte el cráneo junto con la línea media posterior-anterior, y luego corte dos veces más a través de la sutura coronal y la sutura lambdoidea (Figura 1A).
7. Retire el cráneo entre la sutura coronal y la sutura lambdoidea de modo que el cerebro quede expuesto. Cortar el bulbo olfatorio y separar el prosencéfalo del mesencéfalo con una cuchilla fina (Figura 1B). Retire el cerebro del cráneo con una espátula delgada y colóquelo sobre el papel de filtro en la tapa de la placa de Petri.
   nota: Los pasos 2.6 y 2.7 deben realizarse lo más rápido posible para reducir la muerte celular.
8. Para preservar la integridad de las entradas sensoriales y corticales al dLGN en el corte cerebral, separe los dos hemisferios con un corte parasagital con un ángulo de 3-5° (Figura 1C, D). Seque los planos mediolaterales de los dos hemisferios colocándolos sobre el papel de filtro y luego péguelos en la etapa de corte con un ángulo de 10-25° con respecto al plano horizontal (Figura 1E).
9. Coloque la platina en el centro de la bandeja tampón metálica y vierta suavemente el resto de la solución de disección helada en la bandeja tampón. Realice este paso con cuidado, ya que un vertido fuerte podría eliminar el cerebro pegado (Figura 1F).
10. Coloque la bandeja tampón en la bandeja llena de hielo, lo que ayuda a mantener la temperatura baja durante la disección. Corta rodajas de 250 μm con una cuchilla de afeitar a una velocidad de 0,1 mm/s y una amplitud de 1 mm.
11. Mantenga los cortes en la cámara de retención llenos de solución de disección oxigenada a 34 °C durante unos 30 minutos y luego deje que los cortes se recuperen en la solución de registro a 34 °C durante otros 30 minutos.
12. Después de la recuperación, retire la cámara de retención de rebanadas del baño de agua y mantenga las rebanadas a temperatura ambiente (RT) hasta que se usen en experimentos.

>3. Electrofisiología

1. Tire de las pipetas con capilares de vidrio de borosilicato y un extractor de filamentos. Mantenga la resistencia de las pipetas de grabación a 3-4 MΩ. Tire de las pipetas estimulantes utilizando el mismo protocolo, pero rompa ligeramente la punta después de tirar para aumentar el diámetro. Llene las pipetas de registro con la solución intracelular y biocitina, mientras llena las pipetas estimulantes con la solución de registro.
2. Coloque los cortes en la cámara de grabación y perfunda continuamente los cortes con solución de grabación oxigenada en RT. Revise todos los cortes y seleccione los que muestren un tracto óptico intacto.
3. Visualice el corte y las células con un microscopio vertical equipado con microscopía de video de contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC).
   nota: Las neuronas de relevo se diferencian de las interneuronas por su mayor tamaño de soma y más dendritas primarias (ramas que emergen del soma). Las interneuronas muestran una morfología bipolar con un soma más pequeño.
4. Coloque la pipeta estimulante en la rebanada antes de parchear la célula con la pipeta registradora. Para investigar las sinapsis retinogeniculadas, coloque la pipeta estimulante directamente en el tracto óptico, donde se agrupan las fibras axónicas de las células ganglionares de la retina (Figura 2A). Para analizar las sinapsis corticogeniculadas, coloque el electrodo estimulante en el núcleo reticularis thalami, que es rostroventralmente adyacente al dLGN (Figura 2B).
5. Una vez que la pipeta de grabación esté sumergida en la solución de grabación, aplique un paso de voltaje de 5 mV para controlar la resistencia de la pipeta. Establezca el potencial de retención en 0 mV y cancele el potencial de compensación para que la corriente de retención sea de 0 pA.
6. Acérquese a la célula con la pipeta registradora mientras aplica presión positiva. Cuando la pipeta esté en contacto directo con la membrana celular, libere la presión positiva y ajuste el potencial de retención a -70 mV. Aplique una ligera presión negativa para permitir que la membrana celular se adhiera a la pipeta de vidrio de modo que se forme un sello de gigaohmios (resistencia >1 GΩ). Compense la capacitancia de la pipeta y abra la celda mediante la aplicación de pulsos de presión negativa.
7. Para investigar la función sináptica, aplique pulsos de corriente de 0,1 ms (aprox. 30 μA) a través de la pipeta de estimulación. Si no se observan respuestas sinápticas, es posible que sea necesario reemplazar las pipetas estimulantes. Tenga cuidado al colocar las pipetas estimulantes en una posición diferente para que la célula registrada no se pierda.
   nota: En los registros de ejemplo que se muestran en la Figura 2, se investigó la plasticidad sináptica a corto plazo estimulando el tracto óptico o las fibras corticogeniculadas dos veces con intervalos entre estímulos de 30 ms. La relación de pulsos apareados (PPR) se calculó dividiendo la amplitud de la segunda corriente postsináptica excitatoria (EPSC) por la de la primera EPSC (EPSC2/EPSC1). Cada protocolo de estimulación se repitió 20 veces. La amplitud del EPSC se midió a partir de las corrientes medias de los 20 barridos. El intervalo de tiempo entre cada repetición fue de al menos 5 s para evitar la plasticidad a corto plazo inducida por las repeticiones.
8. Monitoree la resistencia en serie continuamente aplicando un paso de voltaje de 5 mV. Utilice únicamente las celdas con una resistencia en serie inferior a 20 MΩ para el análisis.

Resultados

Figura 1: Esquemas que representan el protocolo de disección. (A) Vista horizontal del cráneo del ratón, que muestra la posición de los cortes iniciales. El primer corte se realizó junto con la sutura sagital, seguido de otros dos cortes junto con la sutura coronal y la sutura lambdoidea, respectivamente. Las líneas discontinuas representan las incisiones. (B) Vista ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
amplificador	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Amplificador de doble abrazadera de parche
CaCl2	SEGURIDAD	1.02382.1000
cloruro de colina	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Microscopio de barrido láser confocal	Microsistemas Leica	TCS SP5
CsCl	SEGURIDAD	1.02038.0100
Cs-gluconato	Preparado por uno		Como no había gluconato de Cs comercial, lo preparamos nosotros mismos
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG
D-APV	Biotendencia	BN0085-100
Cámara digital para microscopio O	Olimpo	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
glucosa	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	Roth	9105.2
Aislador de estímulo de alta corriente	Instrumentos de precisión mundial	A385
Kcl	SEGURIDAD	1.04936.1000
MgCl2	SEGURIDAD	1.05833.0250
Micromanipuladores	Luigs & Neumann	SM7
Miroscopio	Olimpo	BX51
Medio de montaje	ThermoFisher Scientific	P36930
NaCl	Roth	3957.1
NaH2PO4	SEGURIDAD	1.06346.1000
NaHCO3	SEGURIDAD	1.06329.1000
pipeta	Hilgenberg	1807502
Tirador	Sutter	P-1000
cuchilla	Personna	60-0138
Vibratomo semiautomático	Leica Biosystems	VT1200S
SR 95531 bromuro de hidrógeno	Biotendencia	AOB5680-10	Antagonista del receptor GABAA