Implante de un sistema inalámbrico de microelectrodos bidireccionales en el cerebro de una rata

Abstract

Fuente: Melo-Thomas, L., et al., A Interfaz bidireccional inalámbrica para el registro in vivo y la estimulación de la actividad neuronal en ratas que se comportan libremente. J. Vis. Exp. (2017)

El video muestra un procedimiento para implantar una unidad de electrodo multicanal bidireccional inalámbrica en el cerebro de una rata para grabar y estimular redes neuronales multicanal.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Animales

1. Aloje ratas Wistar adultas macho (200-250 g) en grupos de 3-4 en condiciones estándar de laboratorio durante al menos una semana antes de la cirugía para permitir la aclimatación.
2. Dos días después de la cirugía, las ratas de casa se agrupan en parejas. Cubra las jaulas individuales con tapas acrílicas altas. Evite los párpados convencionales hechos de rejilla metálica, ya que los implantes pueden atascarse, lo que aumenta el riesgo de que se dañen y/o se vuelvan inestables con el tiempo.

>2. Cirugía estereotáctica

1. Antes de comenzar la cirugía, organice y prepare los siguientes equipos y materiales:
   1. Obtenga equipo quirúrgico estéril que consiste en tijeras estériles, pinzas de punta roma, espátulas, cortaúñas quirúrgicas, taladro dental y bastoncillos de algodón.
   2. Obtenga medicamentos y productos químicos, como isoflurano, xilocaína, clorhidrato de tramadol, ungüento oftálmico con dexpantenol, peróxido de hidrógeno al 3%, povidona yodada y etanol al 70%.
   3. Obtenga material de fijación que incluya tornillos de acero inoxidable, resina acrílica, pegamento ultravioleta y protector de tapa.
   4. Obtener una unidad de microelectrodo, compuesta por (i) un electrodo único de registro (microelectrodo de tungsteno y platino con aislamiento de vidrio de cuarzo, con forma de punta cónica, diámetro exterior: 80 μm, punta cónica, impedancia a 1 kHz: 500 kOhm) o un tetrodo (microelectrodo de 4 núcleos con aislamiento de platino/tungsteno con aislamiento de vidrio de cuarzo, diámetro exterior: 100 μm, punta cónica, impedancia a 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) un electrodo de estimulación (alambre de platino/iridio (90% platino, 10% iridio), diámetro del núcleo 125 μm, diámetro exterior 150 μm, impedancia <10 kOhm) conectado a una placa de contacto y (iii) un electrodo de referencia de alambre de platino (diámetro del eje, 100 μm; Figura 1A).
   5. Obtenga un portaelectrodos pegado con pegamento soluble en agua a la unidad de microelectrodos y pruebe su funcionalidad con al menos 2 horas de anticipación (Figura 1B).
   6. Obtenga un sistema atado convencional que consta de un preamplificador diferencial, un amplificador principal y un amplificador de filtro de paso de banda para grabaciones.
   7. Obtenga material adicional, como guantes, almohadilla térmica, jeringas y solución salina fisiológica.
   8. Consigue jaulas caseras (largo x ancho x alto: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Procedimiento
   NOTA: La implantación de electrodos se realiza durante una cirugía estereotáctica convencional bajo anestesia con isoflurano.
   1. Asegúrese de que el experimentador lleve guantes, una mascarilla quirúrgica y una bata de laboratorio.
   2. Iniciar la anestesia colocando al animal en una cámara de inducción (isoflurano 4-5%, flujo de oxígeno 1 L/min, duración ~5 min).
   3. Prueba de pérdida de reflejos (reflejos de la cola y de los dedos de los pies) con fórceps para confirmar la anestesia profunda.
   4. Colocar la cabeza del animal en una máscara anestésica fijada alrededor de la barra incisiva superior del marco estereotáctico y ajustar la anestesia (isoflurano 2-3%, flujo de oxígeno 0,7-0,8 L/min).
   5. Fije y alinee horizontalmente la cabeza del animal en el aparato estereotáxico utilizando las barras de los oídos y la barra de incisivos superiores.
   6. Afeitar el campo quirúrgico con una maquinilla quirúrgica o una tijera y esterilizar con povidona yodada.
   7. Coloque al animal sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia y trate los ojos con ungüento ocular de dexpantenol para evitar que se sequen.
   8. Inyecte xilocaína (0,3-0,4 mL, por vía subcutánea, s.c.) en el centro del campo quirúrgico.
   9. Vuelva a hacer la prueba para detectar la pérdida de reflejos.
   10. Haga una pequeña incisión (1,5 cm) con un bisturí en el centro del campo quirúrgico para exponer el cráneo. Separe la piel suavemente y retire el tejido residual con pinzas, tijeras y una espátula.
   11. Limpie cuidadosamente el cráneo con bastoncillos de algodón recubiertos de peróxido de hidrógeno.
   12. Taladre 4-5 agujeros pequeños (4,7 mm) en el cráneo para la fijación de los tornillos de acero inoxidable.
   13. Conecte la unidad de microelectrodo/portaelectrodos al preamplificador y conéctelo al micromanipulador estereotáctico (Figura 1B y 1C).
   14. Perfore un agujero (aproximadamente 7 mm) en el cráneo por encima del área objetivo utilizando las coordenadas de un atlas cerebral según el animal utilizado. En el presente estudio, coloque las puntas de los electrodos dirigidas al colículo inferior utilizando las siguientes coordenadas, con el bregma como referencia: anterior/posterior, -8,8 mm; medial/lateral, 1,5 mm; y dorsal/ventral, 3,5 mm.
   15. Absorbe la sangre con bastoncillos de algodón.
   16. Introduzca verticalmente la unidad de microelectrodo hasta que las puntas de los electrodos alcancen el área objetivo.
   17. Coloque el cable de tierra a lo largo de los tornillos de acero inoxidable y debajo de la piel.
   18. Supervise la actividad de los picos y ajuste cuidadosamente la posición de los electrodos con un micromanipulador hasta llegar a una zona de neuronas activas en la estructura objetivo y detecte la actividad neuronal con una relación señal-ruido adecuada para la clasificación de picos.
   19. Fije la unidad de microelectrodos al cráneo con pegamento ultravioleta y cubra la placa de contacto y los tornillos con resina acrílica.
   20. Inyectar suero fisiológico (1 mL i.p.) y tramadol (25 mg/kg, s.c.) para prevenir la deshidratación y asegurar la analgesia postoperatoria, respectivamente.
   21. Desconecte la unidad de microelectrodos del portaelectrodos con un cepillo empapado en agua.
   22. Detenga la anestesia y retire con cuidado la rata del marco estereotáctico. Desconecte el preamplificador de la unidad de microelectrodos.
   23. Conecte la protección de la tapa en la unidad de microelectrodos implantada y desconéctela solo durante los procedimientos experimentales.

Results

Figura 1: Unidad de microelectrodos TWS. (1) registro de un solo electrodo/tetrodo, (2) electrodo de estimulación, (3) placa de conexión de fibra de electrodo, (4) cables de conexión flexibles, (5) cable de tierra, (6) placa de conectores, (7) conector macho o hembra para el sistema TWS (A); unidad de microelectrodo TWS conectada al preamplificador (8) y al soporte (9); (B

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thomas Wireless System (TWS) versión 2.0	Thomas RECORDING GmbH	AN001165	La versión 2.0 de Thomas Wireless System (TWS) es un sistema de telemetría multicanal portátil con computadora portátil, un sistema operativo Microsoft Windows preinstalado y software de control TWS. El TWS incluye: amplificador principal pre-programable de 4 canales de bajo ruido con ancho de banda fijo, estimulador de corriente constante de un solo canal para la aplicación de pulsos de corriente bifásicos, micro estimulador programable por software, sistema de conectores implantable y una unidad básica de etapa de cabeza para montaje en un animal. El sistema se entrega con un transceptor con conexión de puerto USB para computadoras portátiles o personales de escritorio, el software de control se ejecuta bajo el sistema operativo Windows de Microsoft. El sistema TWS se puede utilizar para la estimulación neuronal extracelular y el registro en animales pequeños que se comportan libremente (por ejemplo, ratas, conejillos de indias). Este sistema también se puede adaptar para ser utilizado en animales más grandes (por ejemplo, primates).
Software para Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	incluido en AN001165	El software para el sistema inalámbrico Thomas se ejecuta bajo el sistema operativo Microsoft Windows y proporciona la interfaz gráfica de usuario (GUI) para el Thomas Wireless System (TWS). La GUI de TWS ofrece un control completo de las funciones de TWS: grabación de 4 canales y estimulación de 1 canal.
Tetrodo implantable para grabación (4 canales) y estimulación (monocanal)	Thomas RECORDING GmbH	AN001132	Tetrodo implantable para grabación (4 canales) y estimulación (monocanal) para uso con Thomas Wireless Systems (TWS). Especificaciones de tetrodo de grabación: material de fibra de tetrodo: fibra de tungsteno de platino aislada con vidrio de cuarzo, diámetro exterior de la fibra de tetrodo: 100 μm, forma de punta D, impedancia 0.5-0.8MOHm; Electrodo de referencia: forma de la punta: D; Impedancia: 300-500kOhm; Material: platino/tungsteno aislado con vidrio de cuarzo; Especificación del electrodo de estimulación: material de fibra: platino / iridio, diámetro: 125 μm, laca aislada, forma de la punta: D, impedancia: < 10 kOhm, el usuario final puede especificar las dimensiones del electrodo
Microelectrodo implantable para registro (monocanal) y estimulación (monocanal)	Thomas RECORDING GmbH	AN001118	Microelectrodo implantable para registro (monocanal) y estimulación (monocanal) para uso con Thomas Wireless Systems (TWS). Especificaciones del electrodo de registro: material de la fibra del electrodo: fibra de tungsteno de platino aislada con vidrio de cuarzo, diámetro exterior de la fibra del electrodo: 80 μm / 250 μm (especifique), forma de la punta D, impedancia 0.5-0.8MOHm; Electrodo de referencia: forma de la punta: D; Impedancia. 300-500kOhm; Material: platino/tungsteno aislado con vidrio de cuarzo; Especificación del electrodo de estimulación: material de fibra: platino / iridio, diámetro: 125 μm, laca aislada, forma de la punta: D, impedancia: < 10 kOhm
Soporte para la implantación de electrodos	Thomas RECORDING GmbH	AN000838	Varilla metálica curvada especial para la implantación de microelectrodos para portaelectrodos estándar. La varilla se utiliza para sujetar un electrodo implantable. El electrodo implantable se fija a la varilla con pegamento soluble en agua especial (AN001080) de Thomas RECORDING. (El soporte de electrodos no está incluido)
Fuente de alimentación del acumulador de repuesto para el sistema inalámbrico Thomas (3,7V/230mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001208	Batería recargable de repuesto (acumulador) para el sistema inalámbrico Thomas con una capacidad de 230 mA para aproximadamente 1 hora de funcionamiento. (tamaño: 27 mm x 20 mm x 6 mm, peso aprox. 6 g)
Fuente de alimentación del acumulador de repuesto para el sistema inalámbrico Thomas (3,7V/450mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001209	Batería recargable de repuesto (acumulador) para el sistema inalámbrico Thomas con una capacidad de 450 mA para más de 1 hora de funcionamiento. (tamaño: 48 mm x 30 mm x 4 mm, peso aprox. 11 g)
Cargador acumulador para acumulador recargable Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	AN001207	Cargador de red para los acumuladores recargables Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 y AN001209)
Pegamento soluble en agua	Thomas RECORDING GmbH	AN001080	El pegamento para electrodos solubles en agua Thomas RECORDING es un producto especialmente seleccionado para su uso con microelectrodos implantables en la investigación neurocientífica. Sus propiedades únicas aseguran una conexión rígida entre el electrodo y el dispositivo de montaje, aunque es fácilmente extraíble con agua tibia. El pegamento para electrodos soluble en agua de Thomas RECORDING se puede utilizar de inmediato, sin necesidad de una preparación que requiera mucho tiempo. El pegamento de electrodos soluble en agua de Thomas RECORDING no es dañino para los seres humanos, los animales o el medio ambiente. Cantidad: 1 caja de 10 gramos
Preamplificador diferencial en miniatura	Thomas RECORDING GmbH	AN000329	El preamplificador diferencial en miniatura, modelo MDPA-2 es un preamplificador de entrada diferencial de 2 canales que está diseñado para grabaciones de bajo ruido a partir de tejido excitable. Está diseñado para el registro extracelular junto con la implantación de microelectrodos implantables para aplicaciones animales en movimiento libre con el Thomas Wireless System (TWS). El preamplificador diferencial en miniatura de 2 canales (MDPA-2) está conectado a los microelectrodos implantables para proporcionar la etapa inicial de amplificación de diez veces. Idealmente, los electrodos de platino/tungsteno con aislamiento de vidrio de cuarzo de Thomas RECORDING se utilizan para obtener resultados de grabación óptimos con altas amplitudes de señal y bajos niveles de ruido. El MDPA-2 tiene entradas adicionales de electrodo de referencia y tierra común.
Cable de conexión	Thomas RECORDING GmbH	AN000330	Cable de conexión para conectar el preamplificador diferencial Thomas Miniature (MDPA-2) a un amplificador principal y a una fuente de alimentación del acumulador.
Fuente de alimentación recargable para el preamplificador en miniatura	Thomas RECORDING GmbH	AN000328	Fuente de alimentación acumuladora recargable para el preamplificador diferencial en miniatura (MDPA-2).
Cargador de acumulador (US)	Thomas RECORDING GmbH	AN000167	Cargador acumulador para la AN000328 de alimentación (conector de toma de corriente de EE. UU.)
Cargador acumulador (UE)	Thomas RECORDING GmbH	AN000168	Cargador acumulador para la fuente de alimentación AN000328 (conector de toma de corriente de la UE)
Preamplificador diferencial/amplificador principal/filtro de paso de banda	Thomas RECORDING GmbH	AN000677	El amplificador principal de CA TREC (LabAmp-03) es un amplificador principal diferencial de un solo canal para aplicaciones neurofisiológicas (por ejemplo, registro extracelular con microelectrodos). Este instrumento está diseñado para trabajar con el preamplificador diferencial en miniatura, modelo MDPA-2. El canal único del LabAmp-03 contiene una etapa de amplificador diferencial de alta ganancia y bajo ruido seguida de filtros de baja y alta frecuencia. El amplificador tiene dos amplificadores de filtro diferentes, un amplificador de filtro de actividad de una sola unidad (SUA) y un amplificador de filtro de potencial de campo local (LFP), ambos están conectados en paralelo en la ruta de la señal. El modo de grabación ofrece dos niveles de ganancia de señal (x10, x100) en una primera etapa y 4 niveles adicionales (x5, x10, x25 y x50) en una etapa final del amplificador. Cada amplificador tiene diferentes características de paso de banda para una sola unidad de actividad (SUA) de 500 Hz...20 kHz y potenciales de campo local (LFP) de 0,1 Hz...140 Hz. Un monitor de audio y un discriminador de ventanas están integrados en el dispositivo. El LabAmp-03 tiene un monitor de audio integrado con altavoz. Esta unidad proporciona reproducción de audio de señales electrofisiológicas. La unidad combina un amplificador de audio en un paquete compacto y resistente. Esto es especialmente adecuado para monitorear la activación neuronal y las contracciones musculares. La entrada del monitor de audio está conectada internamente a la salida del amplificador SUA-Filter. El LabAmp-03 se suministra con una fuente de alimentación externa para un rango de voltaje de operación de red de 100-240 V CA / 50-60 Hz.
Osciloscopio USB	Thomas RECORDING GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Este osciloscopio para PC de 2 canales es perfecto para el uso móvil en un ordenador portátil y la instalación permanente en armarios de control, equipos industriales y muchas otras aplicaciones en las que se requiere un osciloscopio pequeño, ligero y potente. Este osciloscopio está conectado a la salida de señal del amplificador principal para la visualización de la actividad extracelular registrada durante el encendido de los microelectrodos implantables para el Thomas Wireless System (TWS). El usuario puede adquirir los datos de medición a través de las diversas interfaces de datos directamente en el PC con el software de PC incluido.
Generador de estímulos	Sistemas multicanal	STG3008-FA	El generador de estímulo para corriente (STG) y la estimulación impulsada por voltaje cumplen tres funciones: estimulación impulsada por corriente, estimulación impulsada por voltaje, control y temporización. El STG está disponible con 2, 4 u 8 canales de salida independientes. Con unidades de aislamiento integradas para cada canal de salida, el STG es capaz de proporcionar cualquier forma de onda arbitraria.
Protector de tapón para el electrodo	Thomas RECORDING GmbH	AN001193	Tapa protectora para unidad de electrodos implantable para el sistema inalámbrico Thomas
Equipamiento quirúrgico			Tijeras, pinzas de punta roma, espátulas, cortaúñas quirúrgicas, taladro dental y bastoncillos de algodón
Drogas y productos químicos			Isoflurano, xilocaína, clorhidrato de tramadol (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Alemania), ungüento oftálmico dexpantenol (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Alemania), peróxido de hidrógeno al 3%, povidona yodada (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburgo, Alemania) y etanol al 70%;
Material de fijación, incluido			Tornillos de acero inoxidable (BN650 M1.2x5; 4,7 mm), resina acrílica (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Alemania), cola ultravioleta (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Alemania) y protector de tapas (Thomas Recording GmbH, Giessen, Alemania);
Material adicional			Guantes, almohadilla térmica, jeringas y solución salina fisiológica.
Instrumento estereotáxico para pequeños animales (SASI)	Thomas RECORDING GmbH	AN000287	El modelo debe elegirse de acuerdo con el animal (rata, conejillo de indias, monos, etc.) utilizado en el estudio
Cámara de video	EverFocus (Enfoque Eterno)		EverFocus, modelo: EQ150