Fotoestimulación y registros de pinza de parche de células enteras de neuronas en cortes de hipocampo de ratón

Resumen

Fuente: Richevaux, L., et al. Inyecciones estereotáxicas intracerebrales in vivo para la estimulación optogenética de entradas de largo alcance en cortes de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2019)

El video muestra un protocolo para estudiar las interacciones sinápticas y las respuestas neuronales en un corte de cerebro de hipocampo de ratón transfectado. Consiste en iluminar neuronas sensoriales de largo alcance para desencadenar potenciales de acción y registrar los potenciales postsinápticos excitatorios resultantes en la neurona registrada mediante la técnica de patch-clamp de célula completa.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Soluciones para el registro de cortes agudos

1. Prepare soluciones madre de 10 veces la solución de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) (124 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO₃, 1 mM de NaH₂PO₄ y 11 mM de D-glucosa) en agua pura desionizada antes de los experimentos de electrofisiología. Almacene la solución a 4 °C en un frasco de 1 L sin CaCl₂ y MgCl₂.
2. Prepare la solución de pipeta a base de gl....

Resultados

Figura 1: Neurona de la capa III presubicular: propiedades intrínsecas, respuesta a la estimulación lumínica de las aferencias talámicas y revelación post-hoc de la morfología celular. (A) Variación del patrón de disparo y del potencial de membrana de la neurona de la capa III para los pasos de corriente hiperpolarizante y despolarizante. (B, C) Respuestas de la neur.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kcl	sigma	P4504	final 1,2 mM
Cloruro de magnesio	sigma	63069	final 2 mM
MultiClamp 700B	Instrumentos Axon
Software de adquisición pClamp	Instrumentos Axon
Bomba peristáltica	Gilson	Minipuls 3	14-16 en la pantalla para 2-3 ml/min
Gluconato de potasio (K-gluconato)	sigma	G4500	Final 135 mM
Capilares de borosilicato	Aparato Havard	CG150-10	1,5 mm exterior, 0,86 diámetro interior
Marrón Extractor de electrodos en llamas	Instrumentos Sutter	P-87
EGTA	sigma	E4368	Final 0,2 mM
LED de 470 nm	Investigación de Cairn	P1105/470/LED DC/59022m	Uso con filtro de excitación adaptado 470/40x y filtro de emisión para GFP
AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Núcleo vectorial de Penn	AV-5-PV3446	Lote V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
Cámara CCD	Andor	DL-604M
Microscopio confocal	Zeiss	LSM710	20 veces
Digidata 1440A	Instrumentos Axon
Medidor óptico digital de mano	ThorLabs (en inglés)	PM100D	Parametrizado en 475 nm
HEPES	sigma	H3375	Final 10 mM
Fuente de alimentación LED	Investigación de Cairn	Fuente de luz OptoLED