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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Soluciones para el registro de cortes agudos
- Prepare soluciones madre de 10 veces la solución de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) (124 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1 mM de NaH2PO4 y 11 mM de D-glucosa) en agua pura desionizada antes de los experimentos de electrofisiología. Almacene la solución a 4 °C en un frasco de 1 L sin CaCl2 y MgCl2.
- Prepare la solución de pipeta a base de gluconato de potasio para que contenga 135 mM de K-gluconato, 1,2 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,2 mM de EGTA, 2 mM de MgCl2, 4 mM de MgATP, 0,4 mM de Tris-GTP, 10 mM de Na2-fosfocreatina y 2,7-7,1 mM de biocitina para la revelación de la morfología celular post-hoc. Ajuste el pH de la solución a 7,3 y la osmolaridad a 290 mOsm. Almacene alícuotas de 1 ml a -20 °C.
>2. Grabación de patch-clamp de célula completa
- Transfiera suavemente un trozo de cerebro que contenga el complejo del hipocampo con una pipeta de transferencia de vidrio hecha a medida a la cámara de registro montada en un microscopio vertical. Una pipeta de transferencia está hecha de una pipeta Pasteur acortada (diámetro interior de 6,5 mm) unida a una pera de pipeta de goma. Perfundir continuamente la cámara de registro (3 mL) con aCSF a 34 °C (calentado) burbujeado con 95%/5% de O2/CO2. Ajuste la velocidad de la bomba peristáltica a 2-3 mL/min.
- Examine brevemente la expresión de Chronos-GFP en los terminales de los axones en la región de interés con iluminación LED azul (470 nm) y observe con un objetivo 4x. La fluorescencia GFP se visualiza a través de un filtro de emisión apropiado, con una imagen de cámara CCD que se muestra en la pantalla de una computadora.
- Coloque un ancla de rebanada hecha de un alambre de platino en forma de U con cuerdas de nailon muy espaciadas ("arpa") en la rebanada para mantenerla.
- Cambia a un objetivo de inmersión de 63x y ajusta el enfoque. Compruebe si hay axones que expresen Chronos-GFP y elija una neurona piramidal para el registro de parches.
- Mueve el objetivo hacia arriba.
- Extraiga las pipetas con un extractor de electrodos Brown-Flaming de vidrio de borosilicato. El extractor está configurado para producir pipetas de aproximadamente 1 μm de diámetro de punta. Llene las pipetas con una solución interna a base de K-gluconato.
- Monte la pipeta en el soporte de pipetas en la platina principal. Baje la pipeta en la cámara y encuentre la punta debajo del objetivo. La resistencia de la pipeta debe estar entre 3 y 8 MΩ. Aplique una ligera presión positiva con una jeringa para ver cómo sale un cono de solución de la pipeta y baje progresivamente la pipeta y el objetivo hasta la superficie de la loncha.
- Parchear la célula en configuración de pinza de voltaje: acérquese a la neurona identificada y presione delicadamente la punta de la pipeta sobre el soma. La presión positiva debe producir un hoyuelo en la superficie de la membrana. Libere la presión para crear un sello de giga-ohmios (resistencia de >1 GΩ). Una vez sellado, ajuste el voltaje de retención a -65 mV. Romper la membrana con un pulso brusco de presión negativa: esto se logra aplicando una fuerte succión a un tubo conectado al soporte de la pipeta.
- Registre en modo de pinza de corriente de celda completa las respuestas de la neurona a los pasos de corriente hiperpolarizante y despolarizante (Figura 1A).
nota: Este protocolo se utilizará para determinar las propiedades intrínsecas activas y pasivas de la célula. Las rutinas de MATLAB escritas a medida se utilizan para el análisis fuera de línea.
- Registre las respuestas postsinápticas de pinza de corriente o voltaje a la estimulación LED de campo completo de 475 nm de fibras aferentes que expresan Chronos. Estimular con trenes de 10 estimulaciones de 2 ms de duración a 20 Hz (Figura 1 B, C). La intensidad de la luz puede variar de 0,1 a 2 mW.
nota: La intensidad de la luz se midió con una consola digital de potencia óptica portátil equipada con un sensor de fotodiodo, colocado debajo del objetivo. Las latencias de respuesta de 2 a 4 ms son características de una conexión monosináptica.
