Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de hardware y software para grabaciones multicanal
- Configure un sistema de adquisición de datos de 16 canales de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
nota: Se pueden utilizar varios amplificadores y sistemas de adquisición de datos disponibles en el mercado para recopilar grabaciones multicanal. En los experimentos descritos aquí, las señales analógicas se entregan a través de un panel de referencia de electrodos a dos amplificadores, donde se amplifican (2000x) y se filtran (0,1-10 kHz). Las entradas analógicas al sistema de adquisición de datos se digitalizan a 40 kHz.
- Fije el adaptador de platina de cabeza de 16 canales adecuado a un micromanipulador de microscopio. Oriente el adaptador de modo que los puertos del conector hembra miren hacia abajo.
- Ajuste el ángulo de operación de este micromanipulador de manera que esté orientado hacia abajo, hacia la cámara de grabación, en un ángulo de aproximadamente 70° con respecto a la horizontal.
- Conecte la entrada de la etapa principal a una sonda de 16 x 1 para electrofisiología in vitro a través del adaptador de la etapa principal anclado al micromanipulador.
- Conecte el conector de salida de la etapa principal al sistema de adquisición de datos.
- Instale el software adecuado para la adquisición de datos. Configure 15 canales de entrada para que se correspondan con las señales de entrada de los primeros 15 contactos de sonda multicanal. Configure el canal restante para recibir la entrada del electrodo intracelular.
nota: Al recopilar y analizar datos, tenga cuidado de tener en cuenta los mapas de electrodos y adaptadores para asegurarse de que la señal adecuada corresponda al contacto del electrodo del que se recolectó.
>2. Configuración de protocolos de estimulación lumínica
- Configure un sistema de suministro de luz e instale el software que lo acompaña.
- Abra el software. Elija una configuración de cableado de hardware en la que una fuente de disparo (salida digital/TTL (lógica de transistor-transistor)) proporcione una señal de entrada de disparo al sistema de suministro de luz, y el sistema de entrega de luz proporcione una señal de salida de disparo a un LED (diodo emisor de luz) de 470 nm.
- Monta una lente de objetivo de alta potencia. Con una cámara digital, calibre los objetivos de alta potencia con el sistema de suministro de luz.
- Cree una nueva secuencia de perfiles de estimulación de luz.
- Crea un patrón de elección. En los experimentos descritos aquí, un círculo de 150 μm de diámetro permite la activación específica de la capa de los terminales axónicos.
- Para construir una secuencia de perfiles, copie y pegue este perfil para cada uno de los números de ensayos.
- Cree una lista de formas de onda que contenga formas de onda de cualquier intensidad de luz, duración de pulso o número de pulso.
- Asigne formas de onda aleatoriamente a cada perfil. Cada perfil con su forma de onda asignada corresponde a un pulso de disparo de una entrada TTL digital o una prueba.
- Guarde la secuencia de perfiles.
- En el software de adquisición de datos, cree un nuevo protocolo.
- Establezca el número de ensayos para que sea igual al número de perfiles de la secuencia de perfiles creada.
- Elija entradas de señal que coincidan con las configuradas en el paso 1.6. Configure un protocolo que proporcione una única salida TTL digital, grabando desde estos 16 canales de entrada durante un período de tiempo adecuado antes y después del disparo digital.
>3. Colocación de una sonda multicanal en un corte de tejido cerebral ex vivo
- Perfundir eACSF (líquido cefalorraquídeo artificial experimental) (no en bolsas selladas) a 3-6 mL/min.
- Transfiera el corte de cerebro que contiene un área de interés a la rejilla de malla en una cámara de perfusión de microscopio. Ancla con arpa de platino
- Gire la rejilla de malla de modo que la línea de contactos de electrodos en el extremo distal de la sonda multicanal sea aproximadamente perpendicular a la superficie del pial.
- Baje la sonda multicanal hacia la superficie de la rebanada bajo una iluminación de campo amplio y un control preciso del micromanipulador.
- Gire la torreta del cubo de filtro para acoplar el cubo de filtro apropiado para visualizar la proteína reportera fluorescente expresada en los terminales axónicos de las aferencias corticales. Si es necesario, gire el corte para alinear con mayor precisión la sonda con la superficie del pial.
- Coloque la sonda justo por encima del plano del corte, ~ 200 μm por debajo de la posición objetivo final a lo largo del eje x, dejando al menos un canal fuera del límite del área de tejido que se está registrando.
- Inserte lentamente la sonda en el corte moviendo el manipulador a lo largo de su eje longitudinal. Para minimizar el daño al tejido, solo avance la sonda hasta la medida en que las puntas afiladas sean visibles justo debajo de la superficie del tejido. Esto minimizará el daño al tejido y, al mismo tiempo, garantizará que los contactos de los electrodos estén en contacto con el tejido.
>4. Fijación de parches para neuronas objetivo y obtención de la configuración de la célula completa
- Cambie la fuente eACSF a la solución de control en bolsa.
- Identifique las células marcadas con fluorescencia para el registro de pinzas de parche dirigidas.
- Restrinja el diafragma del iris de apertura al diámetro más pequeño. Acople una lente de objetivo de baja potencia y enfoque el tejido.
- Centre la luz sobre un área de tejido adyacente (pero no superpuesta) a la sonda multicanal.
- Acople el objetivo de inmersión en agua de alta potencia (40x o 60x), teniendo cuidado para evitar el contacto entre la sonda multicanal y la lente del objetivo.
- Gire la torreta del cubo de filtro para activar el conjunto de filtros adecuado para permitir la obtención de imágenes de células que expresan un marcador fluorescente dependiente de Cre.
- Identifique una célula marcada con fluorescencia como objetivo para el registro de pinzas de parche. Levante la lente del objetivo para crear un amplio espacio para bajar una pipeta de parche.
- Cargue una pipeta de parche (consulte la Tabla 1) con solución interna (Tabla 2) y monte la pipeta en el soporte de electrodos. Con una jeringa de 1 ml, aplique una presión positiva correspondiente a ~0,1 ml de aire.
- Baje la pipeta de parche en la solución. Coloque la punta de la pipeta bajo guía visual.
- Obtenga el registro de la célula completa de la célula objetivo utilizando los pasos demostrados anteriormente33.
- Si planea evaluar cambios en las propiedades intrínsecas de la celda (por ejemplo, resistencia de entrada, velocidad de disparo potencial de acción en respuesta a los pasos actuales), realice estos registros. De lo contrario, pase al protocolo de estimulación de axones a continuación.
Tabla 1: Composición del líquido cefalorraquídeo artificial y solución intracelular. Se enumeran los reactivos y las concentraciones para eACSF y la solución de pipeta intracelular para los registros de pinzas de parche.
| Experimento ACSF, eACSF (en mM) |
| NaCl | Artículo 111 |
| NaHCO3 | 35 |
| HEPES | 20 |
| Kcl | 1.8 |
| CaCl2 | 2.1 |
| MgSO4 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 |
| glucosa | 10 |
| Solución interna |
| K-gluconato | 140 |
| NaCl | 10 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0.1 |
| MgATP | 4 |
| NaGTP | 0.3 |
| pH = 7,2 |
