Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparaciones prequirúrgicas
- Preparación de la solución de electrodos
- Para hacer la solución de relleno de electrodos, prepare una solución de acetato de potasio 4 M con cloruro de potasio 140 mM.
- Preparación de electrodos
- Usando succión al vacío, inserte una fibra de carbono T-650 (7 μm de diámetro) en un capilar de vidrio de borosilicato (longitud = 100 mm, diámetro = 1,0 mm, diámetro interior = 0,5 mm).
- Una vez que la fibra de carbono se haya colocado dentro del capilar de vidrio, coloque el capilar de vidrio en un extractor de electrodos vertical, con el elemento calefactor aproximadamente en el medio del capilar. Ajuste el calentador a 55 con el imán apagado.
- Después de tirar del capilar, levante con cuidado el soporte del capilar superior para que la punta del electrodo no quede rodeada por el elemento calefactor.
- Con unas tijeras afiladas, corte la fibra de carbono que aún conecta las dos piezas del capilar. Esto dará como resultado dos microelectrodos de fibra de carbono separados.
- Bajo un microscopio óptico, corte cuidadosamente la fibra de carbono expuesta con un bisturí afilado para que se extienda aproximadamente 75-100 μm más allá del extremo del vidrio.
- Con un microscopio óptico, asegúrese de que el electrodo esté libre de grietas a lo largo del capilar y que el sello donde la fibra de carbono sale del capilar sea difícil de notar y esté libre de grietas><.
nota: Un buen sellado ayudará a reducir el ruido durante las grabaciones.
- Fabricación de electrodos de referencia
- Suelde un alfiler de oro a un alambre de plata de 5 cm.
- Conecte el ánodo a un clip de metal u otro conductor, el cátodo a un alfiler y aplique un voltaje (~ 2 V) mientras el clip y el cable de plata se sumergen en HCl de 0,1 M.
- Cese el voltaje una vez que aparezca una capa blanca (AgCl) en el cable plateado.
- Preparación de los electrodos para la implantación
- Suelde un alfiler de oro a un alambre aislado delgado (~ 10 cm de longitud, <0,50 mm de diámetro).
- Retire ~ 5 cm de aislamiento del cable opuesto al alfiler dorado.
- Llene el electrodo aproximadamente hasta la mitad con la solución de electrodo.
- Inserte el cable aislado en el electrodo.
nota: El cable debe entrar en contacto con la fibra de carbono dentro del electrodo.
>2. Implantes de electrodos
- Administre a ratas Sprague Dawley macho adultas (250-450 g) una inyección intraperitoneal (1,5 g/kg o 1 mL/kg de volumen) de 0,5 g/mL de uretano disuelto en solución salina estéril. Comience con una dosis inicial de uretano de 1,0-1,2 g/kg. Si el animal sigue respondiendo a la prueba de estímulo nocivo (pellizco de la cola) 20 min después de la administración de uretano, administre 0,3−0,5 g/kg de uretano adicional para una dosis total de 1,5 g/kg.
nota: Para preparar la solución de uretano de 0,5 g/mL, agregue 10 g de uretano a 10 g (~10 mL) de solución salina. El uretano es un carcinógeno y debe manipularse con cuidado. Sin embargo, es un anestésico importante, ya que no altera los niveles de dopamina, como sí lo hacen otros anestésicos como la ketamina/xilacina y el hidrato de cloral.
- Una vez que el animal esté profundamente anestesiado y no responda a los estímulos nocivos (por ejemplo, pellizco en los dedos de los pies), colóquelo en el marco estereotáxico. Aplique lubricante oftálmico en cada ojo de la rata.
nota: Se trata de una cirugía que no es de supervivencia, pero se recomienda una buena técnica aséptica.
- Limpie el cuero cabelludo de la rata con un exfoliante de dos etapas (es decir, un exfoliante con yodopovidona seguido de un exfoliante con etanol al 70%; realice con una repetición de 3 ciclos).
- Corte el tejido del cuero cabelludo con pinzas de punta de aguja esterilizadas y tijeras quirúrgicas. Extraiga una cantidad significativa de tejido para dejar espacio para las diversas implantaciones que se describen a continuación.
- Limpie suavemente la superficie del cráneo con aplicadores de punta de algodón esterilizados. A continuación, aplique 2-3 gotas de peróxido de hidrógeno al 3% para ayudar a identificar la lambda y el bregma.
- Con un taladro estereotáxico o manual (1,0 mm, ~20.000 rpm), perfore un orificio de 1,5 mm de diámetro, 2,5 mm anterior al bregma y 3,5 mm lateral al bregma. Implante parcialmente (aproximadamente a la mitad, hasta que esté firmemente en su lugar) un tornillo (1,59 mm de diámetro exterior, 3,2 mm de largo) en este orificio. Se recomienda utilizar solución salina estéril para irrigar durante la perforación para evitar lesiones térmicas.
- Para el electrodo de referencia, perfore un orificio de 1,0 mm de diámetro, 1,5 mm anterior y 3,5 mm lateral al bregma, en el hemisferio izquierdo.
- Con la mano, inserte ~ 2 mm de cable de referencia en este orificio mientras envuelve el cable de referencia alrededor y debajo de la cabeza del tornillo implantado.
- Implante completamente el tornillo, fijando el electrodo de referencia en su lugar.
- En el hemisferio derecho, perfore un orificio de 1,5 mm de diámetro, 1,2 mm anterior y 1,4 mm lateral a la bregma.
- Retire suavemente la duramadre con unas pinzas.
- Para el electrodo estimulante, perfore un orificio cuadrado (2 mm antero-posterior, 5 mm medial-lateral) centrado a 5,2 mm posterior y 1,0 mm lateral al bregma.
- Con las barras estereotácticas del brazo, baje el electrodo estimulante bipolar/cánula guía 5 mm por debajo de la duramadre. En caso de sangrado durante la implantación del electrodo, utilice bastoncillos de algodón estériles y gasas para minimizar el sangrado.
nota: El electrodo estimulante bipolar utilizado en este método está preinstalado con una cánula guía (Tabla de Materiales). La cánula interna utilizada con este artículo debe enjuagarse con las puntas del electrodo estimulante bipolar cuando esté completamente insertada en la cánula guía. Esto permitirá que la cánula interna se sitúe directamente entre las dos puntas del estimulador, que se encuentran a una distancia de aproximadamente 1 mm. Un protocolo similar se describe en otra parte.
- Usando las barras estereotácticas de los brazos, baje el microelectrodo de fibra de carbono 4 mm por debajo de la duramadre. Esta ubicación se encuentra en la porción más dorsal del cuerpo estriado.
- Conecte el cable de referencia y la fibra de carbono a un potenciostato.
- Aplique una forma de onda triangular (-0,4−1,3 V, 400 V/s) durante 15 min a 60 Hz, y de nuevo durante 10 min a 10 Hz.
nota: Por lo general, al aplicar formas de onda a los microelectrodos de fibra de carbono en el cerebro, se agregan grupos de óxido a la superficie de la fibra de carbono. El equilibrio de esta reacción debe alcanzarse antes del registro; de lo contrario, se producirá una deriva significativa19. El ciclo del electrodo a frecuencias más altas (60 Hz) permite que la fibra de carbono alcance el equilibrio más rápido.
>3. Optimización de la fibra de carbono y estimulación de las ubicaciones de los electrodos/cánulas guía
- Configure el estimulador para que produzca una forma de onda eléctrica bipolar, con una frecuencia de 60 Hz, 24 pulsos, corriente de 300 μA y un ancho de pulso de 2 ms/fase.
- Baje suavemente el estimulador en incrementos de 0,2 mm, de 5 mm a 7,8 mm por debajo de la duramadre. En cada incremento, estimule el VTA.
nota: A más profundidades dorsales (5-6 mm), la estimulación del cerebro normalmente (~80% de las veces) hará que los bigotes de la rata se contraigan. A mayores profundidades, los bigotes dejarán de temblar, lo que ocurre entre 7,5 y 8,2 mm por debajo de la duramadre. Cuando los bigotes dejen de temblar, el electrodo estimulante estará cerca o en el VTA. Esto no ocurrirá en todas las ratas, y la falta de espasmos de los bigotes no debe tomarse como una señal de que el electrodo estimulante bipolar/cánula de infusión está fuera de lugar. Es posible que los espasmos de los bigotes no ocurran con todos los anestésicos (por ejemplo, isoflurano).
- Continúe bajando el electrodo estimulante bipolar/cánula guía hasta que una estimulación produzca una liberación fásica de DA en el microelectrodo de fibra de carbono (actualmente en el cuerpo estriado dorsal).
nota: La liberación de DA en el estriado dorsal no siempre ocurrirá si el electrodo bipolar se implanta en el VTA, pero la observación de la liberación de DA en el cuerpo estriado dorsal tras la estimulación del VTA suele ser una buena señal de que se observará una buena señal en el núcleo de NAc.
- Baje el microelectrodo de fibra de carbono hasta que esté al menos 6,0 mm por debajo de la duramadre. Es la parte más dorsal del núcleo NAc.
- Estimule el VTA y registre la amplitud del pico del DA.
- Baje o suba el microelectrodo de fibra de carbono en el sitio que produce la mayor liberación de DA.
- Asegúrese de que el pico de respuesta DA sea un pico de oxidación claro a 0,6 V y un pico de reducción a -0,2 V. Estos picos indican DA.
>4. Infusión combinada y estimulación Registro FSCV
NOTA: La Figura 1 muestra la línea de tiempo para el registro antes y después de la microinfusión de VTA.
- Una vez que se haya optimizado la ubicación de la fibra de carbono y la cánula del electrodo estimulante/guía, estimule durante ~ 20−30 min.
nota: De acuerdo con los parámetros de estimulación actuales, no estimular más de una vez cada 3 min, para permitir la recarga vesicular22.
- Después de lograr una línea de base estable (variación del <20% en cinco estimulaciones), baje suavemente la cánula interna con la mano en la cánula guía que está preinstalada en el estimulador bipolar.
- Realice 2 o 3 grabaciones de referencia adicionales para asegurarse de que la inserción de la cánula en sí no cambie la señal evocada. En algunos casos, la inserción y extracción de la cánula interna puede dañar el VTA. Si la señal cambia drásticamente durante este período de referencia (>20%), realice 3-4 grabaciones adicionales hasta que la línea de base se vuelva a estabilizar.
- Usando una bomba de jeringa y una microjeringa, infunda 0,5 μL de solución (p. ej., solución salina al 0,9%, ácido N-metil-D-aspartato [NMDA], ácido (2R)-amino-5-fosfonovalérico [AP5]) en el VTA durante un período de 2 minutos.
- Después de la infusión, deje la cánula interna durante al menos 1 minuto antes de retirarla.
nota: Algunos medicamentos pueden requerir dejar la cánula interna durante más tiempo según la cinética del medicamento, y la extracción de la cánula interna puede hacer que el medicamento regrese a través de la cánula interna. Si hay inquietud, se puede dejar la cánula interna en la cánula guía durante la totalidad de la grabación. De lo contrario, la grabación puede comenzar después de este intervalo de 1 minuto.
- Continúe grabando cada 3 minutos para medir los efectos posteriores a la infusión.
nota: Si se infunde una solución de control, y no se observa ningún efecto, es posible infundir una segunda vez10. Si hay una liberación alterada de DA causada por la inserción de la cánula interna o la infusión de solución salina, la señal generalmente se recupera a la línea de base dentro de los 30 minutos.
