Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Sellado de celdas para grabación
- Asegúrese de que todos los equipos (microscopio, amplificador, digitalizador, micromanipulador y otros) estén encendidos antes de comenzar la grabación.
- Llene la cámara de registro, de una marca comercial (Tabla de Materiales), conéctela al microscopio con la solución aCSF para grabaciones. Utilice una bomba de perfusión para perfundir constantemente el líquido cefalorraquídeo aCSF a una velocidad de 2 mL/min.
- Transfiera una porción de cerebro de interés (una a la vez) a la cámara de grabación. Utilice una pipeta de transferencia acrílica (pipeta de vidrio Pasteur invertida unida a una tetina de silicona) para transferir las rodajas hipotalámicas a la cámara. Utilice un anclaje de rebanada (Tabla de Materiales) para sujetar la rebanada de modo que no se mueva durante la perfusión del aCSF.
- Coloque un corte en el centro de la cámara de registro conectada al microscopio. La posición del corte es fundamental para permitir una buena visión de la región deseada bajo el microscopio y para un alcance perfecto de la micropipeta de registro.
- Utilice la lente del objetivo de baja potencia de un microscopio de inmersión (10x o 20x) para ayudar a posicionar el corte y localizar la región de interés.
- Después de localizar la región de interés, cambie la lente del objetivo a la lente de alta potencia (63x) y concéntrese en el nivel del tejido, observando la proteína fluorescente endógena y las formas de las células en la región objetivo para localizar las células de kisspeptina en la superficie del corte de cerebro.
- Cuando se encuentre una posible celda objetivo, márquela en la pantalla de la computadora con el cursor del mouse o dibujando un formato, como un cuadrado, sobre el área de interés. La marca de la pantalla del ordenador ayuda a guiar la posición de la micropipeta de grabación hasta la célula.
- Después de determinar la ubicación exacta de la célula objetivo, levante el objetivo e introduzca la micropipeta de registro llena de la solución interna. Al colocar la micropipeta en el portaelectrodos, asegúrese de que la solución interna esté en contacto con el electrodo de plata.
nota: Para la preparación, colocación y posicionamiento de micropipetas en el portaelectrodos.
- Aplique presión positiva antes de sumergir la micropipeta en la solución de aCSF, para evitar que entren residuos en la micropipeta, utilizando una jeringa llena de aire de 1-3 mL conectada al soporte de la micropipeta a través de un tubo de polietileno (≈130 cm más largo); aplique casi 100-200 μL de aire.
- Con el micromanipulador, guíe la micropipeta por debajo del centro del objetivo. Mueva los botones del micromanipulador para guiar la micropipeta en el eje X-Y-Z hacia la celda de interés.
- Ajuste el enfoque para ver la punta de la micropipeta y acerque el enfoque, pero no demasiado, a la rebanada. Reduzca la velocidad del micromanipulador y baje lentamente la micropipeta hasta el plano de enfoque. Asegúrese de que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en la rebanada, sino que descienda lentamente hasta que toque la superficie de la célula/región objetivo.
- Aplique una ligera presión positiva (≈100 μL) con la jeringa llena de aire de 1-3 ml conectada al soporte de la micropipeta para eliminar cualquier residuo de la vía de aproximación.
- Concéntrese en la célula objetivo y mueva lentamente el micromanipulador en el eje X-Y-Z para acercar la micropipeta a ella. Al tocar la micropipeta con la célula, se observará un hoyuelo causado por la presión aplicada a través de la punta de la micropipeta (Figura 2C).
- Después de formar el hoyuelo, debido a la proximidad de la micropipeta a la célula, aplique una succión oral débil y breve (1-2 s) a través del tubo conectado al soporte de la micropipeta para generar el sello entre la micropipeta y la célula (sello de gigaohmios o gigasello >1 GΩ; Figura 2D). Para formar el sello, utilice el modo de abrazadera de voltaje en el software.
- Si el sello permanece estable (el sello de gigaohmios debe ser mecánicamente estable y sin interferencias de ruido, determinado por observación durante aproximadamente 1 minuto), ajuste el voltaje de retención al potencial de reposo fisiológico más cercano de la celda de interés. Para las neuronas hipotalámicas de kisspeptina, se recomienda -50 mV.
- Aplicar una breve succión por vía oral (presión negativa) con la micropipeta sellada a la célula para romper la membrana plasmática (Figura 2E). La configuración adecuada de la célula entera se logra cuando la succión se realiza con suficiente fuerza para que la membrana rota no obstruya la micropipeta y no atraiga una porción considerable de la membrana o incluso la célula.
- Verifique el manual de configuración del sistema utilizado. Utilice el software (consulte la tabla de materiales) para verificar y calcular digitalmente la resistencia en serie (SR) y la capacitancia de toda la celda (WCC).
- En el modo de pinza de voltaje, después de romper la membrana de la celda, habilite la opción de celda completa y haga clic en el comando Auto que se refiere a la pestaña de toda la celda. El SR y el wcc de la celda se calcularán automáticamente y el software los mostrará al instante. Estos parámetros también se pueden verificar realizando la prueba de membrana con el amplificador mencionado en la Tabla de Materiales.
- Asegúrese de comprobar los parámetros de viabilidad de la célula. En el caso de las neuronas kisspeptina, compruebe que las mediciones electrofisiológicas sean: SR < 25 mΩ, resistencia de entrada > 0,3 GΩ y que el valor absoluto de corriente de mantenimiento sea < 30 pA. El valor medio de la WCC de las neuronas AVPV/PeNKisspeptina o ARHkisspeptina es de ≈ 10-12 pF en ratones con gónadas intactas.
- Monitoree el SR y la capacitancia de estado estacionario de la celda durante los experimentos. Asegúrese de que el SR no cambie más del 20% durante una grabación y que la capacitancia de la membrana sea estable.
- Compruebe la configuración del software. Crear protocolos específicos para las grabaciones según el tipo de experimento. Para registrar el potencial de la membrana en el modo de pinza amperimétrica, con el equipo mencionado en la Tabla de Materiales, el paso bajo filtra las señales electrofisiológicas a 2-4 kHz y analiza los resultados fuera de línea en el software (consulte la Tabla de Materiales para obtener información sobre el software).
- Una vez que se haya logrado correctamente la configuración de toda la celda, mida las corrientes sinápticas en el modo de pinza de voltaje (Figura 2G). Registre los cambios en el potencial de membrana en reposo (RMP) y las variaciones inducidas de RMP en el modo de pinza de corriente (Figura 2H). Los cambios en la RMP, como la despolarización de la membrana celular, pueden inducirse mediante la administración de un fármaco/neurotransmisor conocido en el baño (descrito en el paso 1.2), como se ilustra en la Figura 1.
nota: En el modo de pinza amperimétrica, se puede inyectar corriente positiva o negativa para mantener el voltaje de la membrana a un voltaje deseado. En el caso de las neuronas kisspeptina, solemos establecer una inyección de corriente cero (I = 0) para registrar la variación espontánea del potencial de membrana.
