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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Electrofisiología in vitro
- Preparación de soluciones para la preparación y registro de cortes de médula espinal
- Líquido cefalorraquídeo artificial
nota: El líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) se utiliza en una cámara de incubación interfaz, donde se almacenan los cortes hasta que comienza el registro y durante los experimentos como perfusor y diluyente para los fármacos. Consulte la Tabla 1 para ver la composición detallada.
- Prepare un CSF que contenga (en mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glucosa, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 y 2,5 CaCl2 añadiendo las cantidades necesarias de lo anterior, excluido el CaCl2, a 2 L de agua destilada.
- Burbujee la solución anterior con carbógeno (95% O2, 5% CO2) durante 5 min y agregue CaCl2.
nota: Este paso evita la precipitación de CaCl2, es decir, la solución no debe volverse turbia. Para la aplicación del fármaco durante los experimentos, diluya las soluciones madre del fármaco en aCSF hasta las concentraciones finales deseadas.
>2. Líquido cefalorraquídeo artificial sustituido por sacarosa
NOTA: El aCSF sustituido por sacarosa se utiliza durante la disección y el corte de la médula espinal. Como su nombre lo indica, la sacarosa se sustituye por NaCl para reducir la excitación neuronal durante estos procedimientos mientras se mantiene la osmolaridad. Consulte la Tabla 1 para ver la composición detallada.
- Prepare aCSF sustituido por sacarosa que contenga (en mM) 250 sacarosa, 25 NaHCO3, 10 glucosa, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 y 2,5 CaCl2 añadiendo las cantidades necesarias de todo lo anterior, excluyendo el CaCl2, a 300 mL de agua destilada.
- Burbujee la solución con carbógeno durante 5 minutos y luego agregue CaCl2.
- Almacene la solución en un congelador a -80 °C durante aproximadamente 40 minutos o hasta que la solución forme una suspensión. Evite congelar sólidos y úselo mientras tenga consistencia de lodo.
>3. Preparación de la matriz de microelectrodos
NOTA: La superficie de contacto del MEA requiere un tratamiento previo para hacerla hidrófila.
- Antes del experimento, llene bien el MEA con suero fetal bovino (FBS) o suero equino (HS) durante 30 minutos.
- Retire el FBS o HS y enjuague bien el MEA con aproximadamente cinco lavados de agua destilada hasta que el agua destilada ya no esté espumosa. Llene el pocillo con CSF, listo para usar.
>4. Preparación aguda del corte de la médula espinal
- Anestesiar profundamente al ratón con 100 mg/kg de ketamina (i.p.) y luego decapitarlo con unas tijeras quirúrgicas grandes.
- Retire la piel sobre la región abdominal haciendo un pequeño corte en la piel a la altura de las caderas. Tire de la piel a ambos lados del corte rostralmente hasta que se retire toda la piel, es decir, desde la parte superior de la caja torácica hasta la parte superior de la pelvis (tanto ventral como dorsalmente).
- Coloque el cuerpo sobre hielo y use un enfoque ventral para exponer la columna vertebral eliminando todas las vísceras y cortando las costillas laterales al esternón.
- Retire la caja torácica ventral, ambas escápulas (cortadas aproximadamente en T2), y las extremidades inferiores y la pelvis (cortadas aproximadamente en la parte superior del sacro).
- Transfiera la columna vertebral y la preparación de las costillas a un baño de disección que contenga sacarosa aCSF helada. Sujete con alfileres las cuatro esquinas de la preparación (superficie ventral hacia arriba) colocando clavos a través de los músculos de la parte inferior de la espalda y las costillas superiores adjuntas.
- Extirpar todo el músculo y el tejido conectivo que recubre la superficie ventral de las vértebras con rongeurs e identificar la región vertebral sobre el agrandamiento lumbosacro, que se encuentra aproximadamente debajo de los cuerpos vertebrales T12 a L2.
- Extirpar un cuerpo vertebral que es caudal a la región de agrandamiento lumbosacro para proporcionar acceso a la médula espinal mientras se encuentra en el canal vertebral.
- Con unas tijeras elásticas curvas, corte los pedículos vertebrales bilateralmente mientras levanta y tira del cuerpo vertebral rostralmente para separar los aspectos ventral y dorsal de las vértebras y exponer la médula espinal.
- Una vez que se hayan extirpado los cuerpos vertebrales para revelar el agrandamiento lumbosacro, limpie con cuidado las raíces restantes que anclan la médula espinal con unas tijeras de resorte hasta que la médula flote libremente.
- Aísle la médula espinal con cortes rostrales y caudales muy por encima y por debajo del agrandamiento lumbosacro, permitiendo que la región objetivo de la médula "flote libremente><".
nota: La orientación de corte preferida determinará cómo se monta posteriormente el cable para el corte (Figura 1).
- Para cortes transversales, levante el segmento lumbosacro por una raíz adjunta y colóquelo sobre un bloque de poliestireno (espuma de poliestireno) precortado (1 cm x 1 cm x 1 cm) con un corte de canal poco profundo en el centro. Utilice adhesivo de cianoacrilato (consulte la Tabla de materiales) para sujetar el bloque y el cordón a la plataforma de corte y colóquelo en el baño de corte que contiene sacarosa aCSF (suspensión) helada.
nota: El canal poco profundo ayuda a asegurar y orientar la médula espinal, con el lado dorsal expuesto y el extremo torácico de la médula en la parte inferior del bloque.
- Para los cortes sagitales, coloque una línea delgada de adhesivo de cianoacrilato en la plataforma de sección, levante el agrandamiento lumbosacro con una raíz adjunta y coloque el cordón a lo largo de la línea de pegamento, asegurándose de que una superficie lateral esté en el adhesivo y la otra hacia arriba. Colóquelo en el baño de corte que contiene sacarosa helada aCSF (suspensión).
- Para cortes horizontales, coloque una línea delgada de adhesivo de cianoacrilato en la plataforma de sección. Levante el agrandamiento lumbosacro por una raíz adherida y coloque el agrandamiento lumbosacro a lo largo de la línea del adhesivo, asegurándose de que la superficie ventral esté en el adhesivo y la superficie dorsal hacia arriba. Use las raíces adjuntas para colocar el cordón. Colóquelo en el baño de corte que contiene sacarosa helada aCSF (suspensión).
>5. Grabaciones de matrices de microelectrodos
NOTA: Los siguientes pasos detallan cómo utilizar los datos de registro de experimentos basados en MEA en cortes de médula espinal. Se pueden utilizar varios diseños de MEA dependiendo del experimento. En la Tabla 2 y la Figura 2 se muestran los detalles del diseño de los AMUMA utilizados en estos experimentos. Egert et al. y Thiebaud et al. han publicado información detallada sobre el diseño para los MEAs planos y tridimensionales (3D), respectivamente. Ambos tipos de MEA están compuestos por 60 electrodos de nitruro de titanio, con una capa aislante de nitruro de silicio y pistas y almohadillas de contacto de nitruro de titanio.
- Configuración experimental
- Encienda la computadora y la placa de interfaz, e inicie el software de grabación.
- Cargue la plantilla de grabación premontada (Figura 3A). Asigne un nombre a los archivos del día en la pestaña de la grabadora.
- Burbujear continuamente aCSF con carbógeno (5% CO2, 95% O2) durante la duración del experimento.
- Encienda el sistema de perfusión, que está controlado por una bomba peristáltica. Coloque la línea de entrada en un CSF y el extremo de entrada en un vaso de precipitados. Prepare las líneas de perfusión con aCSF.
- Prepare 4-AP y cualquier otra solución farmacológica diluyendo las existencias en 50 mL de aCSF hasta la concentración final requerida (por ejemplo, 200 μM para 4-AP).
- Actividad de la 4-aminopiridina (4-AP)
- Después de la incubación, transfiera una sola rebanada de la incubadora con una pipeta Pasteur de punta grande llena de aCSF.
- Coloque la rebanada en el pozo MEA y agregue aCSF adicional.
- Coloque el corte sobre la matriz de registro de 60 electrodos con un pincel fino de pelo corto. Evite el contacto de los electrodos con el pincel o el arrastre del tejido a través de los electrodos, especialmente si utiliza matrices 3D.
nota: Dependiendo del diseño de MEA, esto se puede hacer con o sin la ayuda de un microscopio para un posicionamiento preciso.
- Después de colocar la rebanada, coloque una red con peso sobre el tejido para mantenerlo en su lugar y promover un buen contacto con los electrodos MEA.
nota: Es posible que sea necesario reposicionar la rebanada después de la colocación de la red.
- Coloque el MEA en la cabecera de grabación (Figura 2A, B).
- Verifique la posición del tejido sobre los electrodos usando un microscopio invertido (aumento de 2x) para confirmar que tantos electrodos como sea posible estén debajo del asta dorsal superficial (SDH). Asegúrese de que al menos 2-6 electrodos no entren en contacto con el corte, ya que estos electrodos son importantes para sustraer ruido y registrar artefactos durante el análisis (Figura 2E).
- Encienda la cámara, conéctela al dispositivo y tome una imagen de referencia del corte en relación con el MEA para usarla durante el análisis.
- Presione Iniciar DAQ (adquisición de datos) en el software de grabación y confirme que todos los electrodos estén recibiendo una señal clara.
nota: Si la señal es ruidosa, suelte la etapa principal y limpie las almohadillas de contacto MEA y los contactos de resorte dorado con etanol al 70% (use una toallita de laboratorio para asegurarse de que las almohadillas y los contactos estén secos después de la limpieza). Si la señal sigue siendo ruidosa, apague los electrodos que no funcionen correctamente en el software de grabación o anótelos para excluirlos más adelante durante el análisis.
- Conecte las líneas de entrada y salida de perfusión al pocillo MEA (previamente lleno con aCSF) y encienda el sistema de perfusión. Verifique el caudal, idealmente de 4 a 6 volúmenes de baño por minuto, y asegúrese de que el flujo de salida sea suficiente para evitar el desbordamiento del superfusado.
- Deje que el tejido se equilibre durante 5 minutos y luego registre 5 minutos de datos de referencia sin procesar y sin filtrar.
- Mueva la línea de entrada de perfusión de aCSF a una solución 4-AP y espere 12 min para que la actividad rítmica inducida por 4-AP alcance el estado estacionario (2 min para que los fármacos alcancen el baño y 10 min para que la actividad alcance su punto máximo y luego se estabilice).
- Registre 5 minutos de actividad inducida por 4-AP. Esté preparado para grabaciones posteriores para probar los medicamentos o para verificar la estabilidad de 4-AP.
Tabla 1: Composiciones del líquido cefalorraquídeo artificial.
| químico | aCSF (mM) | aCSF (g/100 mL) | ACSF sustituido por sacarosa (mM) | ACSF sustituido por sacarosa (g/100 mL) | ACSF con alto contenido de potasio (mM) | ACSF con alto contenido de potasio (g/100 mL) |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Artículo 118 | 0.690 | - | - | Artículo 118 | 0.690 |
| Hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3) | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 |
| glucosa | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 |
| Cloruro de potasio (KCl) | 2.5 | 0.019 | 2.5 | 0.019 | 4.5 | 0.034 |
| Dihidrógeno fosfato de sodio (NaH2, PO4) | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 |
| sacarosa | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tabla 2: Disposición de las matrices de microelectrodos.
| Diseños de matrices de microelectrodos |
| Modelo de matriz de microelectrodos | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Planar o tridimensional (3D) | planar | 3d | 3d | planar |
| Rejilla de electrodos | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
| Espaciado de electrodos | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Diámetro del electrodo | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Altura del electrodo (3D) | N/A | 40 μm | 50 μm | N/A |
| Experimentos | Corte transversal | Corte transversal | Sagital + Horizontal | Sagital + Horizontal |
