Evaluación de redes neuronales en cortes de médula espinal de ratón mediante matrices de microelectrodos

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Electrofisiología in vitro

1. Preparación de soluciones para la preparación y registro de cortes de médula espinal
   1. Líquido cefalorraquídeo artificial
      nota: El líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) se utiliza en una cámara de incubación interfaz, donde se almacenan los cortes hasta que comienza el registro y durante los experimentos como perfusor y diluyente para los fármacos. Consulte la Tabla 1 para ver la composición detallada.
2. Prepare un CSF que contenga (en mM) 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 10 glucosa, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ y 2,5 CaCl₂ añadiendo las cantidades necesarias de lo anterior, excluido el CaCl₂, a 2 L de agua destilada.
3. Burbujee la solución anterior con carbógeno (95% O₂, 5% CO₂) durante 5 min y agregue CaCl₂.
   nota: Este paso evita la precipitación de CaCl₂, es decir, la solución no debe volverse turbia. Para la aplicación del fármaco durante los experimentos, diluya las soluciones madre del fármaco en aCSF hasta las concentraciones finales deseadas.

>2. Líquido cefalorraquídeo artificial sustituido por sacarosa

NOTA: El aCSF sustituido por sacarosa se utiliza durante la disección y el corte de la médula espinal. Como su nombre lo indica, la sacarosa se sustituye por NaCl para reducir la excitación neuronal durante estos procedimientos mientras se mantiene la osmolaridad. Consulte la Tabla 1 para ver la composición detallada.

1. Prepare aCSF sustituido por sacarosa que contenga (en mM) 250 sacarosa, 25 NaHCO₃, 10 glucosa, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ y 2,5 CaCl₂ añadiendo las cantidades necesarias de todo lo anterior, excluyendo el CaCl₂, a 300 mL de agua destilada.
2. Burbujee la solución con carbógeno durante 5 minutos y luego agregue CaCl₂.
3. Almacene la solución en un congelador a -80 °C durante aproximadamente 40 minutos o hasta que la solución forme una suspensión. Evite congelar sólidos y úselo mientras tenga consistencia de lodo.

>3. Preparación de la matriz de microelectrodos

NOTA: La superficie de contacto del MEA requiere un tratamiento previo para hacerla hidrófila.

1. Antes del experimento, llene bien el MEA con suero fetal bovino (FBS) o suero equino (HS) durante 30 minutos.
2. Retire el FBS o HS y enjuague bien el MEA con aproximadamente cinco lavados de agua destilada hasta que el agua destilada ya no esté espumosa. Llene el pocillo con CSF, listo para usar.

>4. Preparación aguda del corte de la médula espinal

1. Anestesiar profundamente al ratón con 100 mg/kg de ketamina (i.p.) y luego decapitarlo con unas tijeras quirúrgicas grandes.
2. Retire la piel sobre la región abdominal haciendo un pequeño corte en la piel a la altura de las caderas. Tire de la piel a ambos lados del corte rostralmente hasta que se retire toda la piel, es decir, desde la parte superior de la caja torácica hasta la parte superior de la pelvis (tanto ventral como dorsalmente).
3. Coloque el cuerpo sobre hielo y use un enfoque ventral para exponer la columna vertebral eliminando todas las vísceras y cortando las costillas laterales al esternón.
4. Retire la caja torácica ventral, ambas escápulas (cortadas aproximadamente en T2), y las extremidades inferiores y la pelvis (cortadas aproximadamente en la parte superior del sacro).
5. Transfiera la columna vertebral y la preparación de las costillas a un baño de disección que contenga sacarosa aCSF helada. Sujete con alfileres las cuatro esquinas de la preparación (superficie ventral hacia arriba) colocando clavos a través de los músculos de la parte inferior de la espalda y las costillas superiores adjuntas.
6. Extirpar todo el músculo y el tejido conectivo que recubre la superficie ventral de las vértebras con rongeurs e identificar la región vertebral sobre el agrandamiento lumbosacro, que se encuentra aproximadamente debajo de los cuerpos vertebrales T12 a L2.
7. Extirpar un cuerpo vertebral que es caudal a la región de agrandamiento lumbosacro para proporcionar acceso a la médula espinal mientras se encuentra en el canal vertebral.
8. Con unas tijeras elásticas curvas, corte los pedículos vertebrales bilateralmente mientras levanta y tira del cuerpo vertebral rostralmente para separar los aspectos ventral y dorsal de las vértebras y exponer la médula espinal.
9. Una vez que se hayan extirpado los cuerpos vertebrales para revelar el agrandamiento lumbosacro, limpie con cuidado las raíces restantes que anclan la médula espinal con unas tijeras de resorte hasta que la médula flote libremente.
10. Aísle la médula espinal con cortes rostrales y caudales muy por encima y por debajo del agrandamiento lumbosacro, permitiendo que la región objetivo de la médula "flote libremente><". nota: La orientación de corte preferida determinará cómo se monta posteriormente el cable para el corte (Figura 1).
11. Para cortes transversales, levante el segmento lumbosacro por una raíz adjunta y colóquelo sobre un bloque de poliestireno (espuma de poliestireno) precortado (1 cm x 1 cm x 1 cm) con un corte de canal poco profundo en el centro. Utilice adhesivo de cianoacrilato (consulte la Tabla de materiales) para sujetar el bloque y el cordón a la plataforma de corte y colóquelo en el baño de corte que contiene sacarosa aCSF (suspensión) helada.
    nota: El canal poco profundo ayuda a asegurar y orientar la médula espinal, con el lado dorsal expuesto y el extremo torácico de la médula en la parte inferior del bloque.
12. Para los cortes sagitales, coloque una línea delgada de adhesivo de cianoacrilato en la plataforma de sección, levante el agrandamiento lumbosacro con una raíz adjunta y coloque el cordón a lo largo de la línea de pegamento, asegurándose de que una superficie lateral esté en el adhesivo y la otra hacia arriba. Colóquelo en el baño de corte que contiene sacarosa helada aCSF (suspensión).
13. Para cortes horizontales, coloque una línea delgada de adhesivo de cianoacrilato en la plataforma de sección. Levante el agrandamiento lumbosacro por una raíz adherida y coloque el agrandamiento lumbosacro a lo largo de la línea del adhesivo, asegurándose de que la superficie ventral esté en el adhesivo y la superficie dorsal hacia arriba. Use las raíces adjuntas para colocar el cordón. Colóquelo en el baño de corte que contiene sacarosa helada aCSF (suspensión).

>5. Grabaciones de matrices de microelectrodos

NOTA: Los siguientes pasos detallan cómo utilizar los datos de registro de experimentos basados en MEA en cortes de médula espinal. Se pueden utilizar varios diseños de MEA dependiendo del experimento. En la Tabla 2 y la Figura 2 se muestran los detalles del diseño de los AMUMA utilizados en estos experimentos. Egert et al. y Thiebaud et al. han publicado información detallada sobre el diseño para los MEAs planos y tridimensionales (3D), respectivamente. Ambos tipos de MEA están compuestos por 60 electrodos de nitruro de titanio, con una capa aislante de nitruro de silicio y pistas y almohadillas de contacto de nitruro de titanio.

1. Configuración experimental
   1. Encienda la computadora y la placa de interfaz, e inicie el software de grabación.
   2. Cargue la plantilla de grabación premontada (Figura 3A). Asigne un nombre a los archivos del día en la pestaña de la grabadora.
   3. Burbujear continuamente aCSF con carbógeno (5% CO₂, 95% O₂) durante la duración del experimento.
   4. Encienda el sistema de perfusión, que está controlado por una bomba peristáltica. Coloque la línea de entrada en un CSF y el extremo de entrada en un vaso de precipitados. Prepare las líneas de perfusión con aCSF.
   5. Prepare 4-AP y cualquier otra solución farmacológica diluyendo las existencias en 50 mL de aCSF hasta la concentración final requerida (por ejemplo, 200 μM para 4-AP).
2. Actividad de la 4-aminopiridina (4-AP)
   1. Después de la incubación, transfiera una sola rebanada de la incubadora con una pipeta Pasteur de punta grande llena de aCSF.
   2. Coloque la rebanada en el pozo MEA y agregue aCSF adicional.
   3. Coloque el corte sobre la matriz de registro de 60 electrodos con un pincel fino de pelo corto. Evite el contacto de los electrodos con el pincel o el arrastre del tejido a través de los electrodos, especialmente si utiliza matrices 3D.
      nota: Dependiendo del diseño de MEA, esto se puede hacer con o sin la ayuda de un microscopio para un posicionamiento preciso.
   4. Después de colocar la rebanada, coloque una red con peso sobre el tejido para mantenerlo en su lugar y promover un buen contacto con los electrodos MEA.
      nota: Es posible que sea necesario reposicionar la rebanada después de la colocación de la red.
   5. Coloque el MEA en la cabecera de grabación (Figura 2A, B).
   6. Verifique la posición del tejido sobre los electrodos usando un microscopio invertido (aumento de 2x) para confirmar que tantos electrodos como sea posible estén debajo del asta dorsal superficial (SDH). Asegúrese de que al menos 2-6 electrodos no entren en contacto con el corte, ya que estos electrodos son importantes para sustraer ruido y registrar artefactos durante el análisis (Figura 2E).
   7. Encienda la cámara, conéctela al dispositivo y tome una imagen de referencia del corte en relación con el MEA para usarla durante el análisis.
   8. Presione Iniciar DAQ (adquisición de datos) en el software de grabación y confirme que todos los electrodos estén recibiendo una señal clara.
      nota: Si la señal es ruidosa, suelte la etapa principal y limpie las almohadillas de contacto MEA y los contactos de resorte dorado con etanol al 70% (use una toallita de laboratorio para asegurarse de que las almohadillas y los contactos estén secos después de la limpieza). Si la señal sigue siendo ruidosa, apague los electrodos que no funcionen correctamente en el software de grabación o anótelos para excluirlos más adelante durante el análisis.
   9. Conecte las líneas de entrada y salida de perfusión al pocillo MEA (previamente lleno con aCSF) y encienda el sistema de perfusión. Verifique el caudal, idealmente de 4 a 6 volúmenes de baño por minuto, y asegúrese de que el flujo de salida sea suficiente para evitar el desbordamiento del superfusado.
   10. Deje que el tejido se equilibre durante 5 minutos y luego registre 5 minutos de datos de referencia sin procesar y sin filtrar.
   11. Mueva la línea de entrada de perfusión de aCSF a una solución 4-AP y espere 12 min para que la actividad rítmica inducida por 4-AP alcance el estado estacionario (2 min para que los fármacos alcancen el baño y 10 min para que la actividad alcance su punto máximo y luego se estabilice).
   12. Registre 5 minutos de actividad inducida por 4-AP. Esté preparado para grabaciones posteriores para probar los medicamentos o para verificar la estabilidad de 4-AP.

Tabla 1: Composiciones del líquido cefalorraquídeo artificial.

Tabla 2: Disposición de las matrices de microelectrodos.

Figura 1: Orientaciones de los cortes de la médula espinal, métodos de montaje y corte. (A) Las rebanadas transversales requieren un bloque de corte de espuma de poliestireno con una ranura de soporte cortada en él. La médula espinal se apoya contra el bloque en el surco de soporte, con el lado dorsal de la médula en dirección opuesta al bloqueo. El bloque y el cordón se pegan en una etapa de corte con adhesivo de cianocrilato. (B) Las rodajas sagitales se preparan colocando una línea delgada de adhesivo de cianoacrilato en la etapa de corte y luego colocando la médula espinal de lado sobre el pegamento. (C) Las rodajas horizontales se preparan colocando una línea delgada de adhesivo de cianoacrilato en la etapa de corte y luego colocando la médula espinal con el lado ventral hacia abajo sobre el pegamento.

Figura 2: Posicionamiento del tejido en la guía de microelectrodos. (A) La imagen muestra una cabecera abierta de MEA con un MEA colocado en posición. (B) Igual que A con la cabecera de MEA cerrada para registros y sistema de perfusión de tejidos en su lugar. (C) La imagen muestra un MEA suministrado por el fabricante. Se muestran las almohadillas de contacto, que interactúan con los resortes dorados de la etapa principal, y el baño de tejido MEA que contiene la solución de baño de tejido y la rebanada de tejido. El área resaltada por el cuadrado rojo en el centro es la ubicación de la guía de electrodos. (D) Los esquemas muestran las dos configuraciones de electrodos MEA utilizadas en este estudio, con más detalles presentados en la Tabla 2. El electrodo de referencia se denota por el trapecio azul. La disposición de los electrodos MEA de la izquierda muestra una configuración cuadrada de 60 electrodos, la más utilizada en los modelos de trabajo presentados 60MEA200/30iR-Ti con electrodos de 30 μm de diámetro espaciados a 200 μm de distancia, o MEAs tridimensionales espaciados de 200 μm y 100 μm espaciados (60MEA200/12/50iR-Ti y 60MEA100/12/40iR-Ti) con electrodos de 12 μm de diámetro y 50 μm o 40 μm de altura, respectivamente. El diseño de electrodos MEA de la izquierda muestra un diseño rectangular de electrodos de 6 x 10-60MEA500/30iR-Ti. (E) Imagen de gran aumento de un MEA cuadrado 60MEA100/12/40iR-Ti con corte transversal de la médula espinal posicionado para la grabación. El corte se asienta en las filas de electrodos 3-8. La fila superior de electrodos, que no entran en contacto con ningún tejido, sirven como electrodos de referencia. El área SDH aparece como una banda semitransparente. En este caso, el SDH superpone los electrodos en las filas 4, 5 y 6 y en las columnas 2, 3, 4, 5 y 7 del MEA. Barra de escala = 200 μm. Abreviaturas: MEA = guía de microelectrodos; SDH = asta dorsal superficial.

Figura 3: Diseños de herramientas de registro y análisis de datos y ejemplos de grabaciones de matrices de microelectrodos que muestran formas de onda de potencial de acción extracelular y potencial de campo local. (A) El esquema muestra la plantilla de registro preconfigurada utilizada para la adquisición de datos MEA. La vinculación de la MEA2100 y la herramienta de grabación (cabecera/amplificador) permite nombrar y guardar los datos. Se recogieron cuatro trazas de ejemplo de datos brutos (derecha, épocas de 5 minutos) mediante un canal MEA que mostraba actividad al inicio, 12 minutos después de la aplicación de 4-AP, otros 15 minutos después de la actividad de 4-AP establecida y después de la aplicación en baño de TTX (1 μM). Tenga en cuenta que la adición de 4-AP (segunda traza) produce un claro aumento en el ruido de fondo y la actividad EAP / LFP. Es importante destacar que la actividad permanece relativamente estable durante al menos 15 minutos después de que se establece la actividad inducida por 4-AP (tercer traza). La adición de TTX (1 μM) suprime toda la actividad (traza de fondo). (B) El esquema (izquierda) muestra la configuración del software del analizador para el análisis de datos. La herramienta de exploración de datos sin procesar se utiliza para importar grabaciones recopiladas por el software de grabación. Luego, estos datos se procesan a través de una herramienta de filtro de canal cruzado que resta las señales de los electrodos de referencia seleccionados de otros electrodos para eliminar el ruido de fondo. Los datos pasan a través del filtro EAP y las herramientas de filtro LFP para optimizar las relaciones señal-ruido para cada forma de onda. Después de este paso, los datos de la ruta EAP ingresan a la herramienta de detección EAP, donde se establecen los umbrales. Los EAP se detectan y, a continuación, se envían a la herramienta de análisis de EAP, donde se registran las latencias de cada evento y se exportan como un txt. archivo. Se produce un flujo de trabajo idéntico para los datos de LFP utilizando un kit de herramientas de LFP correspondiente. Las trazas a la derecha muestran datos de un solo canal MEA que contiene varias formas de onda extracelulares. Las trazas inferiores son épocas de la grabación superior (denotadas por barras rojas) que muestran formas de onda en una escala de tiempo ampliada, incluidas varias señales LFP (nótese la variedad de apariencias) y EAP extracelulares individuales (círculos rojos). Tenga en cuenta que la forma de onda y la polaridad de LFP/EAP varían en relación con el número de neuronas que producen estas señales, su proximidad al electrodo de registro y su ubicación en relación con los electrodos cercanos. Abreviaturas: MEA = guía de microelectrodos; EAP = potencial de acción extracelular; LFP = potencial de campo local; 4-AP = 4-aminopiridina; TTX = tetrodotoxina.