Registro de cambios en la actividad del nervio simpático renal en respuesta a la presión arterial en ratas

Resumen

Fuente: Fink, A. M., et al. Cuantificación de los cambios agudos en la actividad del nervio simpático renal en respuesta a las manipulaciones del sistema nervioso central en ratas anestesiadas. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra una técnica para estudiar la actividad de los nervios simpáticos renales (RSN) en respuesta a cambios en la presión arterial en ratas. Al conectar un catéter sensor de presión a la arteria femoral, los nervios simpáticos renales quedan expuestos. A continuación, los nervios se elevan a un electrodo de registro y se registra su actividad eléctrica. A continuación, se inyecta un fármaco vasoconstrictor para elevar la presión arterial y se controlan los cambios correspondientes en la actividad de la RSN.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Crear electrodos RSNA bipolares

1. Para crear el electrodo, corte dos trozos de alambre de acero inoxidable de aproximadamente 18 mm de largo cada uno. Corte una pieza de tubo de polietileno (PE-50) de aproximadamente 15 mm de largo. Introduzca ambas piezas de alambre en el tubo, dejando que el cable sobresalga de ambos extremos.
2. Retira el aislamiento de los extremos de los cables; recorta los cables dejando 2-3 mm de alambre expuesto. En un extremo, engarce las clavijas macho sobre el cable expuesto. Suelde las clavijas de forma segura al cable, asegure las clavijas dentro de una tira de conectores y cubra la conexión con epoxi.
   nota: Un enfoque alternativo que evita la soldadura es usar pinzas de cocodrilo de conexión/liberación rápida.
3. En el extremo opuesto del electrodo, retire el aislamiento de los extremos de los cables, dejando 2-3 mm de alambre expuesto. Dobla esta parte de los alambres para crear pequeños ganchos en forma de "V" en el alambre sin aislamiento.
   nota: Esta es la porción del electrodo que estará en contacto con el nervio simpático renal. Es importante sellar este extremo para evitar que entren fluidos en la tubería. Se puede utilizar silicona o epoxi de manera efectiva.

>2. Administrar anestesia y preparar sitios quirúrgicos

1. Administrar anestesia a una rata Sprague Dawley macho (de 9 a 11 semanas de edad, con un peso de 150 a 400 g). Administrar pentobarbital sódico 50 mg/kg mediante inyección intraperitoneal (IP). Para evaluar un plano estable de anestesia durante la cirugía, revise el reflejo de pellizco de los dedos del pie cada 15 minutos y vuelva a administrar la anestesia según sea necesario><. nota: El pentobarbital sódico (Nembutal) se utilizó en estudios previos para lograr un plano sostenido de anestesia sin interferir con la modulación del ARSS. Este protocolo es para cirugía que no es de supervivencia, por lo que no hay un período de recuperación/seguimiento postoperatorio.
2. Prepare el sitio quirúrgico de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado animal (es decir, afeitar el abdomen, la espalda y la cabeza de la rata; limpiar la piel con una solución de povidona yodada al 10%; aplicar lubricante para los ojos; y colocar la rata en una almohadilla térmica). Mantenga la temperatura corporal a 37 °C durante los experimentos.

>3. Cánula de la arteria femoral para la monitorización de la presión arterial media

1. Visualice la arteria bajo el microscopio. De manera similar al método utilizado para la canulación venosa, ate la sutura distal para ocluir la arteria; Asegure los bordes de esta sutura al campo quirúrgico con cinta de seda y coloque la arteria perpendicular a la mano dominante del cirujano.
2. Acceso arterial si se utiliza telemetría
   1. Inspeccione el catéter sensor de presión con un aumento alto antes de la canulación arterial. Asegúrese de que el catéter esté libre de burbujas o residuos y que tenga un menisco intacto entre los componentes llenos de líquido (proximales) y llenos de gel (distales). Antes de cada implantación, vuelva a llenar el gel en la punta distal del catéter. Encienda el transmisor con un imán; controlar la presión arterial (PA) durante la cirugía para soportar una colocación perfecta.
   2. Use un medio nudo suelto en la sutura proximal para ocluir brevemente la arteria femoral. Sostenga el introductor del catéter con la mano no dominante. Sujete la punta de la cánula de la unidad de telemetría con pinzas de canulación de vasos para evitar que el gel se desplace de la punta.
   3. Perfore un orificio en la arteria con la aguja 22G doblada e inserte la cánula en la arteria con pinzas de canulación de vasos para evitar desplazar el gel de la punta. Avance la cánula tanto como sea posible. Usando las ataduras de sutura proximal y distal, asegure el catéter de presión.
   4. Mete el cuerpo del implante de telemetría dentro del flanco adyacente a la incisión y cierre esta incisión con una sutura de nailon 4-0 en una aguja de corte. Apague los dispositivos de telemetría mediante un imán al final del período de grabación para conservar la vida útil de la batería.

>4. Coloque a la rata en el marco de la cirugía estereotáxica para acceder al cerebro

1. Mueva suavemente a la rata a la posición prona en el marco de la cirugía estereotáxica.
2. Coloque la rata entre las barras de las orejas y ajuste la barra de incisivos para igualar la altura de lambda y bregma. La posición puede depender de la cepa de la rata, el peso y la ubicación de los objetivos del sistema nervioso central (SNC).
3. Realice una incisión de bisturí rostrocaudal de 2 cm a través de la línea media del cuero cabelludo. Con aplicadores con punta de algodón, retire firmemente el tejido conectivo de la superficie del cráneo. Aplique peróxido de hidrógeno en el cráneo para ayudar a visualizar las suturas de bregma, lambda y línea media.
4. Usando un atlas del cerebro de la rata para guiar la selección de objetivos, perfore una osteotomía con orificio de rebaba, del tamaño adecuado para el acceso a los electrodos, a través del cráneo.

>5. Aislar los nervios simpáticos renales

1. Conecte el electrodo RSNA de cable (pasos 1.1-1.3) a un preamplificador 10X y un amplificador de microelectrodo.
2. Aislar los nervios renales a través de una incisión retroperitoneal antes o después de que la rata se asegure en el marco estereotáxico. Coloque los electrodos RSNA una vez que la rata esté en el marco estereotáxico. Hacer una incisión con bisturí que se extienda desde 4-5 cm por debajo de las costillas en dirección caudal, ligeramente lateral a la columna vertebral. Blunt disecciona la incisión para visualizar los músculos paraespinales.
3. Use tijeras para hacer una incisión rostrocaudal muy superficial de 1-2 cm donde la grasa se encuentra con el músculo. Con aplicadores con punta de algodón, separe la grasa del músculo para visualizar el riñón. Es importante no entrar en el espacio peritoneal.
4. Use retractores para separar suavemente el riñón de los músculos paraespinales para visualizar la arteria renal y la aorta abdominal. No estirar los vasos en exceso para evitar dañar los nervios renales. Use una gasa de algodón de 2" x 2" empapada en solución salina para proteger el riñón de lesiones.
5. Con un aumento alto, identifique los nervios renales en el bolsillo de la incisión. Los haces nerviosos son más fácilmente visibles en el ángulo recto formado por la aorta y la arteria renal. Los nervios renales siguen de cerca la arteria renal desde la aorta hasta los riñones.
6. Seleccione un segmento del haz nervioso que se colocará en el electrodo de registro. Diseccione suavemente las fibras nerviosas del tejido/vaso circundante con pinzas de microdisección.
7. Asegure el electrodo RSNA de alambre en un soporte (por ejemplo, una pinza de cocodrilo unida a un soporte de soporte). Baje el electrodo hasta el nivel del segmento nervioso. Use un gancho nervioso para levantar suavemente el segmento del nervio renal sobre el electrodo sin estirar el nervio><. nota: El nervio debe descansar dentro de ambos ganchos en forma de "V" en el alambre no aislado, paralelos al nervio. Los cables de los electrodos no deben tocar ningún otro tejido, sangre o líquido linfático.
8. Llene la incisión con aceite mineral para evitar que el nervio simpático renal expuesto se seque. Use un clip de conexión a tierra con un extremo en la piel de la incisión y el otro unido a la jaula de Faraday.
9. Dirija la señal a los amplificadores mediante filtrado de paso alto y bajo (10 Hz y 3 kHz). Ajuste la ganancia hasta 10 K. Incluya un monitor de audio para evaluar el patrón de ráfaga del RSNA. Utilice frecuencias de muestreo que oscilan entre 2.000 y 10.000 Hz. Utilice una frecuencia de muestreo aumentada cuando se plantee la hipótesis de que una manipulación del SNC cause respuestas simpáticas rápidas/breves.

>6. Registrar datos

1. Evaluar la calidad del registro de RSNA evocando el barorreflejo con una inyección en bolo de 1 mL de solución salina o 10 μg/mL de fenilefrina (en 0,1 mL) por vía intravenosa. Como se ilustra en la Figura 1, la infusión debería aumentar la PA e inhibir el ARSR. Un aumento de la presión arterial media de 60-80 mmHg es suficiente para la simpatiquisión renal.
2. Ajuste la posición de los electrodos para mejorar la señal si es necesario. Es necesario reposicionar el nervio si el nervio no está en contacto con ambos ganchos del electrodo o si algún tejido, sangre o líquido linfático está en contacto con los cables><. nota: La necesidad de reposicionamiento se basa en las características auditivas de las descargas nerviosas.
3. Una vez que se obtenga una señal clara, asegure el electrodo RSNA en su lugar retirando aceite mineral y aplicando un gel de sílice para cubrir la conexión nervio/electrodo en el bolsillo de la incisión. No muevas la rata antes de que el gel se haya fijado por completo.
4. Realizar protocolos de manipulación del SNC mientras se registra continuamente el RSNA y la presión arterial media. Si se utiliza un microinyector/pulsador para las manipulaciones del tronco encefálico, se puede introducir una señal lógica de este dispositivo en las grabaciones de RSNA/BP para documentar el momento de las manipulaciones del SNC.
5. Una vez finalizado el experimento, determine el nivel de ruido aplastando el nervio proximal a los electrodos de registro entre el gel de sílice y el músculo espinal. Registre al menos 30 s de este valor "cero" para RSNA. Como enfoque alternativo para cuantificar el ruido, administre un bloqueador ganglionar de acción corta como atropina, hexametonio, clorisondamina o tartrato de pentolinio.
6. Retire con cuidado el electrodo RSNA y elimine cualquier rastro de gel de sílice de los electrodos de alambre. Guarde el electrodo para reutilizarlo. Apague el transmisor de telemetría y retírelo, teniendo cuidado de no dañar la punta del catéter.

Resultados

Figura 1: RSNA y BP en respuesta a la inyección de fenilefrina IV.El RSNA bruto (A) fue rectificado de onda completa (B); el RSNA "cero" triturado rectificado se muestra en el recuadro C. Se calcularon promedios de 10 s (menos ruido) no superpuestos (D). Para evocar el barorreflejo, se inyectaron 0,1 mL de fenilefrina (1 μg/mL) por v...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alambre de acero inoxidable	Sistemas A-M; Sequim, WA	791000	Electrodo RSNA
Tubería de polietileno (PE-50)	VWR; Radnor, PA	63019-048	Electrodo de RSNA; canulación de vasos
Conector de clavija en miniatura	Sistemas A-M; Sequim, WA	520200	Electrodo RSNA
Herramienta de crimpado	Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL	M22520	Electrodo RSNA
Regleta de conectores	Anfenol; Municipio de Clinton, MI	De 221 a 2653	Electrodo RSNA
J-B Kwik Epoxi	J-B Weld, Sulphur Springs, TX	8270	Electrodo RSNA
silicona	Permatex; Hartford, CT	Año 2222	Electrodo RSNA
Heparina sódica; Inyectable (vial de 10 mL, 1000 U/mL)	KV Suministro Veterinario; Ciudad de David, NE	P03466	Permeabilidad de la línea venosa
Fenilefrina HCl; Inyectable (vial de 1 mL; 10 mg/mL)	Suministro Quirúrgico ACE; Brockton, MA	950-6312	Pruebas de simpatatiquisición renal
Tirantes quirúrgicos elásticos de un solo gancho	Aparato de Harvard; Holliston, MA	72-2595	incisión
Cinta quirúrgica de seda	3M, Minneapolis, MN	1538-0	Estancias quirúrgicas seguras
Agujas, 20 g	Sigma-Aldrich; San Luis, Missouri	Z192554-100EA	Canulación de vasos
Pinzas curvas Dumont #7	Herramientas de Bellas Ciencias; Foster City, CA	11274-20	Canulación de vasos
5-0 lazos de sutura de seda	Braintree Scientific; Braintree, MA	SUT-S 106	Canulación de vasos
Pinzas hemostáticas delicadas	Roboz Instrumento Quirúrgico Co.; Gaithersburg, MD	RS-7117	Canulación de vasos y cirugía de ARSR
Pinzas hemostáticas Crile	Herramientas de Bellas Ciencias; Foster City, CA	13004-14	Doblado de agujas
Transmisor de telemetría	Internacional de Ciencias de Datos; Minneapolis, MN	PA-10	Monitorización de la presión arterial media (telemetría)
Jeringa de re-gel	Internacional de Ciencias de Datos; Minneapolis, MN	276-0038-001	Reutilización de transmisores (telemetría)
Transductor de presión desechable	Transpac; San Clemente, CA	MI-1224	Monitorización de la presión arterial media
Infusor de presión de manguito transparente	MILA Internacional Inc.; Florencia, Kentucky	2281339	Monitorización de la presión arterial media
Pinzas de canulación de vasos	Herramientas de Bellas Ciencias; Foster City, CA	00574-11	Inserción de catéter
Sutura de nylon monofilamento negro 4-0 en aguja de corte inverso	McKesson Médico-Quirúrgico; San Francisco, CA	S661GX	Transmisor de telemetría seguro
Receptor de telemetría	Internacional de Ciencias de Datos; Minneapolis, MN	RPC-1	Monitorización de la presión arterial media (telemetría)
LabChart Pro (software), PowerLab (hardware de adquisición)	Instrumentos Antidumping; Colorado Springs, CO	ML846, matriz MX2 2.0 (compatible con la telemetría de Data Science International)	3 opciones para software/hardware de adquisición
SciWorks (software), DataWave (hardware de adquisición)	Tecnologías DataWave, Loveland, CO	N/A
Spike 2 (software), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., Londres, Reino Unido	1401-3
Microtaladro	Roboz Instrumento Quirúrgico Co.; Gaithersburg, MD	RS-6300	Cirugía del SNC
Marco de cirugía estereotáxica	Guardando; Wood Dale, Illinois	51600	Cirugía del SNC
Amplificador de microelectrodo con preamplificador 10X	Sistemas A-M; Sequim, WA	1800-2	Grabación RSNA
Retractores	Herramientas de Bellas Ciencias; Foster City, CA	17009-07	Grabación RSNA
Pinzas de microdisección	Herramientas de Bellas Ciencias; Foster City, CA	11251-10	Grabación RSNA
Micro-gancho	Herramientas de Bellas Ciencias; Foster City, CA	10064-14	Grabación RSNA
Aceite mineral	Fisher Scientific; Waltham, MA	8042-47-5	Grabación RSNA
Monitor de audio	Sistemas A-M; Sequim, WA	3300	Grabación RSNA
Gel de sílice	Wacker, München; Alemania	RT601A-B	Grabación RSNA
Pinzas eléctricas	Tyco Electrónica; Schaffhausen, Suiza	EB0283-000	Conexión a tierra o fijación de la aguja de perfusión
Tijeras Bonn, puntas rectas/afiladas	Roboz Instrumento Quirúrgico Co; Gaithersburg, MD	RS-5840	perfusión
Aguja de sonda nasogástrica	Aparato de Harvard; Holliston, MA	75-0286	perfusión
Bomba de perfusión Masterflex	Cole-Parmer; Vernon Hills, Illinois	7524-10	perfusión
Tubo de silicona curado con platino Masterflex	Cole-Parmer; Vernon Hills, Illinois	96410-15	perfusión
Formalina (solución tamponada al 10%; 4 L)	Sigma-Aldrich; San Luis, Missouri	HT501128	perfusión
sacarosa	Sigma-Aldrich; San Luis, Missouri	S0389	Crioprotección