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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Grabaciones de patch-clamp de célula completa
- Transfiera la primera sección de tejido a la cámara de registro sumergida en un flujo continuo de solución de Krebs. Monta la sección con pesos ligeros y sumerge el objetivo.
- Identifique la región estriada en el microscopio y busque neuronas GFP positivas (reprogramadas). Seleccione una neurona que tenga una morfología extensa y que no esté cubierta por haces de fibras o vasos sanguíneos.
- Prepare pipetas de vidrio de borosilicato (3-7 MΩ) para la aplicación de parches y llénelas con la siguiente solución intracelular (en mM): 122,5 gluconato de potasio, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3 Na,3GTP y 8 NaCl, ajustadas a pH 7,3 con KOH.
- Conecte la pipeta de vidrio al electrodo de registro y sumérjala en la solución. Vuelve a verificar la resistencia del electrodo. A continuación, acérquese lentamente a la célula con la pipeta, manteniendo una ligera presión positiva sobre el electrodo para evitar taponar la punta.
cautela: Tenga cuidado de realizar un seguimiento de su celda mientras desciende el electrodo y de no blanquear la fluorescencia en la celda (es decir, apague la lámpara de fluorescencia cuando no la necesite).
- Enjuague el tejido circundante cuidadosamente con la presión positiva del electrodo y acérquese a la celda con el electrodo. Ubique el electrodo justo en la parte superior de la celda y descienda hasta que el electrodo toque la membrana. Haga un sello Giga-Ω entre el electrodo y la membrana de la celda y, con pulsos de presión negativa, rompa la membrana para crear un parche de célula completa.
cautela: Las neuronas reprogramadas son sensibles. Tenga cuidado al parchear y no ejerza demasiada presión negativa al alcanzar un sello Giga-Ω o abrir la membrana celular. Además, el parche en animales mayores requiere práctica y paciencia, ya que su tejido conectivo es más grueso y es más difícil visualizar las neuronas.
- Verifique los potenciales de membrana en reposo inmediatamente después de entrar en el modo de pinza amperimétrica y anótelos para su análisis.
- En la pinza amperimétrica, mantenga la celda entre -60 mV y -80 mV e inyecte corrientes de 500 ms de -20 pA a +90 pA, con incrementos de 10 pA para inducir potenciales de acción.