Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparando al animal para la obtención de imágenes
- Coloque gasas estériles, hisopos de algodón e instrumentos quirúrgicos esterilizados en autoclave en el área de cirugía. Encienda un esterilizador de micro perlas para la esterilización interquirúrgica de herramientas quirúrgicas.
- Anestesiar al ratón (macho o hembra, 1,5-2,5 meses, 20-25 g) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (17,2 mg/mL), xilacina (0,475 mg/mL) y acepromazina (0,238 mg/mL) (6 μL/g de peso corporal). Espere hasta que se alcance la profundidad adecuada de la anestesia cuando el animal deje de responder a un estímulo de pellizco del dedo del pie y no tenga reflejo corneal. Durante la cirugía, administre una dosis de refuerzo de 1/3 de la dosis original del cóctel anestésico según sea necesario para mantener el estado anestésico original.
- Inyecte buprenorfina por vía subcutánea (s.c.; 0,05–0,10 mg/kg) como agente analgésico antes de la cirugía. Aplique ungüento protector en los ojos del animal para evitar la sequedad de la córnea y la formación de cataratas.
- Coloque un ratón transgénico GCaMP6s en una almohadilla térmica para evitar la hipotermia y cúbralo con un paño quirúrgico estéril. Estabilice la cabeza del animal con un adaptador de sujeción de cabeza para ratones.
- Afeita la cabeza sobre la mayor parte del cuero cabelludo con una cuchilla de afeitar de doble filo. Limpie el área quirúrgica con una almohadilla estéril de preparación de alcohol, seguida de una solución de povidona yodada.
>2. Preparación crónica de la ventana craneal
- Haz un corte rectangular del cuero cabelludo (2 mm x 3 mm) con unas tijeras en un lado (derecho) del cráneo. Empuje la piel a un lado con un hisopo de algodón para crear un área de exposición de >3 mm de diámetro (Figura 1A). Extirpe el tejido conectivo adherido al cráneo raspando suavemente el cráneo con una cuchilla microquirúrgica roma (Scalpel Blade #10; Figura 1C).
- Marque el área S1 dibujando suavemente un círculo (3 mm de diámetro, coordinación central: -1,5 mm desde el bregma y 2,5 mm desde la línea media) en el cráneo con un taladro dental (Figura 2B).
- Realice el mismo procedimiento en el cráneo izquierdo (Figura 2B).
- Aplique una capa delgada de Cianoacrilato Super Glue al hueso para proporcionar una base para la aplicación de cemento dental.
- Bajo un microscopio de disección, diluya un surco circular en el cráneo alrededor del área S1 con un microtaladro de alta velocidad (Figura 1D). El propósito es crear un borde suave para la colocación de una ventana óptica sobre él.
- Aplique repetidamente líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, temperatura ambiente) en el cráneo periódicamente durante el proceso de adelgazamiento para facilitar la perforación y disipar el calor. Realice la perforación de forma intermitente para evitar el sobrecalentamiento inducido por la fricción. Aspire los restos óseos con una línea de vacío doméstica o una bomba de vacío.
- Después de perforar aproximadamente 2/3 de profundidad del hueso, diluya lenta y cuidadosamente el 1/3 de hueso restante hasta que una pieza circular del cráneo (colgajo óseo) quede completamente libre del cráneo circundante.
- Retire lenta y cuidadosamente el colgajo óseo circular con un par de pinzas # 5/45 y exponga la duramadre (Figura 2C; Figura 1E).
- Mantenga húmeda la región encefálica expuesta con ACSF (Figura 1E). Evite cualquier daño a los vasos piales, ya que la hemorragia alterará el flujo sanguíneo cerebral, acelerará la inflamación del cerebro y degradará gravemente la calidad de las imágenes.
- Realice el mismo procedimiento en el lado izquierdo (contralateral) del cráneo.
- Para ensamblar la ventana óptica, use adhesivo óptico para pegar y curar entre las capas de vidrio de cobertura una a la vez. Si es necesario, caliente la ventana óptica (50 °C durante 12 h) en una incubadora para mejorar la unión adhesiva. La ventana óptica contiene 2 partes: la parte superior contiene un solo cubreobjetos redondo con un diámetro de 5 mm y la parte inferior contiene de 1 a 3 cubreobjetos redondos con un diámetro de 3 mm (Figura 2D).
- Guarde la ventana óptica en etanol (70%, vol/vol) y enjuáguela con solución salina estéril antes de usarla. Antes de instalar la ventana óptica, revise la ventana óptica en busca de imperfecciones, incluida una cantidad incorrecta de adhesivo óptico o una alineación incorrecta debajo de un estereoscopio.
- Instale la ventana óptica sobre la región de la craneotomía (Figura 2D). La parte superior de la ventana óptica descansa sobre el cráneo, y la parte inferior de la ventana óptica encaja dentro de la abertura craneotomizada y descansa sobre la duramadre en presencia de LCR (Figura 2D, E).
- Selle la parte superior del borde de la ventana óptica al cráneo con el superpegamento de cianoacrilato (Figura 2F; Figura 1F).
- Cuando el Super Glue de Cianoacrilato se haya secado, aplique cemento dental negro (Dentsply) para cubrir el borde del vidrio. Aplique cemento dental a todo el cráneo expuesto y los márgenes de la herida para bloquear la luz (Figura 2G-H; Figura 1B).
- Realice el mismo procedimiento en el lado izquierdo.
- Permita que el animal se recupere en la almohadilla térmica y devuélvalo a su jaula de origen para que se recupere bajo el monitoreo adecuado. Proporcionar comida húmeda para facilitar la masticación y la hidratación. Para reducir el dolor, administre buprenorfina s.c. (0,05-2,0 mg/kg) cada 8-12 h después de la lesión durante 2 días. Deje que el mouse se recupere durante 7 a 10 días adicionales antes de la toma de imágenes.
