Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de tubos, electrodos e instrumentos para el procedimiento quirúrgico
- Utilice los siguientes instrumentos microquirúrgicos: tijeras quirúrgicas, microtijeras en ángulo, pinzas de tejido, un par de micropinzas curvas Dumont #7 y #5, un soporte para microagujas y retractores.
nota: Este es un procedimiento agudo, por lo que no es necesario esterilizar los instrumentos. Después de su uso, limpie y limpie las puntas con etanol al 70%.
- Remoje el tubo en etanol al 70 % y luego enjuáguelo con NaCl estéril al 0,9 % con heparina 100 U/ml antes de usarlo. Deje el tubo lleno para evitar la introducción de burbujas de aire en el sistema.
- Corte un trozo de tubo de polietileno (PE)-50 de 20-30 cm para hacer un catéter para la medición de la presión intracavernosa (PIC). Asegúrese de que el tubo sea lo más corto posible para reducir la presión.
- Doble una aguja estéril de 24 G de lado a lado hasta que la aguja se rompa por la mitad. Conecte la pieza con el bisel al extremo distal del tubo de PE para insertarla en el pene crus. Inserte la otra mitad en el cubo para conectarla al transductor de presión. Llene el sistema con solución salina heparinizada (100 U/mL).
- Para hacer el electrodo bipolar recubierto de teflón, corte dos alambres de plata de 125 μm a la misma longitud. Use un trozo de cinta adhesiva para sujetar los cables al borde de la mesa y enrósquelos. Luego, conecte el electrodo a una placa negra.
- Haga una pequeña incisión en el teflón y use las micropinzas # 5 para quitar una capa de teflón de 4-5 mm de longitud de las puntas de los electrodos. Corta las puntas con un bisturí para lograr una longitud uniforme y crea ganchos doblando los extremos alrededor del borde romo de la hoja de un bisturí.
- Tape el electrodo con el extremo extendiéndose ligeramente sobre el borde de la placa negra con los ganchos apuntando hacia arriba. Mezcle el pegamento de silicona en una placa de plástico durante 10 segundos y envuelva una burbuja de pegamento alrededor del electrodo a 1-2 mm del gancho.
- Deje que se seque durante aproximadamente 5 minutos antes de usarlo (Figura 1). Pele el teflón de una sección más larga en el otro extremo para permitir la conexión al estimulador><.
nota: Al volver a hacer los ganchos en el extremo distal, el electrodo se puede reutilizar muchas veces.
>2. Preparación del animal
- Después de anestesiar al animal, afeitar la mitad inferior del abdomen, el cuello y el perineo. Frote al animal con alcohol al 70% seguido de povidona yodada tres veces. Coloque a la rata sobre una almohadilla quirúrgica caliente en posición supina. Aplique ungüento ocular veterinario y cambie la anestesia por un cono nasal con isoflurano al 2,5% y oxígeno al 0,8 L/min como portador.
nota: Ajuste el nivel de isoflurano y oxígeno para lograr un nivel aceptable de anestesia.
>3. Preparación prequirúrgica
- Realizar todo el procedimiento quirúrgico bajo un microscopio quirúrgico: un aumento de 3,15X a 20X es suficiente. Use guantes y mantenga un ambiente limpio durante toda la cirugía. Coloca la rata en una cortina.
>4. Disección del músculo isquiocavernoso para la medición de la PIC
- Utilice un bisturí, unas tijeras rectas y unas micropinzas curvas Dumont #7 para hacer una incisión vertical en la piel de 1 cm, 5 mm lateral a la línea media, comenzando a nivel de la base del pene y extendiéndose hacia abajo (Figura 2A). Utilice un hisopo y separe cuidadosamente la fascia lateral al escroto (Figura 2B). Después de diseccionar la fascia, coloque retractores y palpe con un intercambiador con punta de algodón para encontrar la tuberosidad isquiática (Figura 2C).
- Diseccionar a través del tejido adiposo medial de este punto hasta visualizar el músculo isquiocavernoso (Figura 3A). Use un par de micropinzas curvas Dumont # 7 y separe longitudinalmente el músculo. La túnica albugínea aparecerá como una estructura de color blanco brillante (Figura 3B). Con micropinzas y una microtijera, exponga la túnica albugínea adecuadamente para ver su curso (Figura 3C).
- Después de calibrar la configuración del sistema, inserte un tubo a través de la piel en el perineo, asegurándose de que corra paralelo a los crus del pene (Figura 4). Deje la vía en su lugar y mantenga la incisión húmeda con solución salina.
5. Disección CN para estimulación
- Realice una incisión abdominal de 2 cm más abajo en la línea media a través de la piel con un bisturí primero y luego con unas tijeras rectas y micropinzas. Cree una incisión a juego a través de la fascia a lo largo de la línea alba y el tejido muscular subyacente para exponer la vejiga y la próstata.
- Use retractores para lograr una buena exposición. Utilice hisopos con punta de algodón para separar la próstata del tejido adiposo y obtener una visualización clara del ganglio pélvico mayor (MPG) y el nervio cavernoso (CN), que se extienden por la cara dorsolateral de la próstata (Figura 5).
- Después de la visualización del MPG y el CN, incida cuidadosamente la fascia que recubre el nervio 2-5 mm distal al MPG con microtijeras en ángulo (Figura 6a). Con el uso de las micropinzas #5, extienda el tejido a cada lado del nervio y debajo de él para liberar una porción de 4 mm de largo (Figura 6b) y deslice una sutura 9-0 debajo del nervio (Figura 6c).
- Eleve ligeramente el nervio con la ayuda de la sutura (Figura 7a) para facilitar la colocación de los ganchos del electrodo bipolar alrededor del nervio (Figura 7b). Deje que un asistente mezcle el pegamento de silicona de dos componentes con la punta de una aguja de insulina durante 5 segundos. Seque el nervio y aplique el pegamento en el área alrededor de los ganchos y el nervio (Figura 7c, d). Mantenga el nervio elevado tirando ligeramente del electrodo durante aproximadamente 1 minuto para permitir que el pegamento se seque.
- Retire los retractores, a excepción de los retractores del lado derecho, para evitar que el electrodo se tire o se tuerza. Humedezca los órganos expuestos con solución salina y coloque una gasa empapada en solución salina sobre la incisión.
>6. Canulación de cuerpos cavernosos para la medición de ICP
- Restaurar la visualización de la túnica albugínea mediante retractores. Asegúrese de no colocar los retractores en el músculo isquiocavernoso, ya que distorsionará el crus.
- Coloque la aguja y enjuague el tubo con solución salina heparinizada antes de introducirlo en la túnica albugínea. Mantenga la túnica albugínea estirada, utilizando micropinzas curvas Dumont #7 en una mano (no dominante), sosteniendo la túnica albugínea y el resto del músculo suprayacente distal al punto de inserción. Sujetar la aguja con micropinzas rectas en la otra mano dominante e introducirla paralela al recorrido del cuerpo cavernoso (Figura 8).
- Empuje la aguja 5-8 mm en el cuerpo cavernoso. Enjuague el tubo y presione los crus para probar la línea (Figura 9). Asegúrese de que no haya fugas. Sujete el tubo a la mesa con cinta adhesiva para evitar tirones accidentales de la línea. Retire los retractores.
>7. Estimulación del CN
- Al ejecutar el programa de registro (por ejemplo, Spike 2), registre continuamente la presión arterial intracavernosa y media.
- Ajuste los siguientes parámetros en un estimulador (por ejemplo, SD9 Grass Instruments, consulte la Tabla de materiales) para la estimulación CN: corriente a 1,5 mA, frecuencia a 16 Hz, voltaje a 3 V y ancho de pulso a 5 ms. Aplique 50 s de estimulación con un mínimo de 1 minuto de descanso entre estimulaciones.
nota: Las primeras estimulaciones suelen dar lugar a una respuesta disminuida (Figura 10).
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