Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por la revisión ética animal apropiada.
1. Preparación de soluciones y materiales
- Soluciones
- Líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (en mM): 117 cloruro de sodio (NaCl), 3,6 cloruro de potasio (KCl), 1,2 dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado (NaH2PO4·2H2O), 2,5 cloruro de calcio dihidratado (CaCl2·2H2O), 1,2 cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2·6H2O), 25 bicarbonato de sodio (NaHCO3), 11 D-glucosa, 0,4 ácido ascórbico, y 2 piruvato de sodio. Ver Tabla 1.
- Prepare una solución intracelular a base de K+ (en mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 Na 2-fosfocreatina, 0,5 etilenglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N",N"-ácido tetraacético (EGTA), ácido 10 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), 4-trifosfato de adenosina de magnesio (Mg-ATP) y trifosfato de guanosina de litio 0,3 (Li-GTP). Ver Tabla 2.
- Prepare una solución intracelular a base de cesio (Cs+) (en mM): 92 sulfonato de metano de cesio (CsMeSO4), 43 cloruro de cesio (CsCl), 10 Na, 2-fosfocreatina, 5 tetraetilamonio (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP y 0,3 Li-GTP. Ver Tabla 3.
nota: Todas las soluciones deben prepararse con agua destilada. ACSF y sacarosa-ACSF deben carbogenarse (mezcla de 95% deO2 y 5% de CO2) antes de su uso para mantener un pH óptimo de aproximadamente 7,4, y la osmolalidad de estas dos soluciones debe ajustarse a 300-310 miliosmoles (mOsm). Debido a que el ácido ascórbico podría afectar a los canales de calcio, este agente debe omitirse si se desea registrar las corrientes de calcio. La osmolalidad y el pH de las soluciones intracelulares deben medirse y ajustarse a 290-300 mOsm y 7,2-7,3, respectivamente. Se recomienda filtrar las soluciones intracelulares con filtros de 0,2 μm y almacenar las soluciones como alícuotas de 1 mL a -20 °C. Cs+ y TEA se aplican en una solución intracelular basada en Cs+ para bloquear el canal de potasio, lo que favorece el uso del amplificador para mantener el potencial de membrana estable a 0 mV cuando se registran corrientes postsinápticas inhibitorias (IPSC).
- Instrumentos
- Para un sistema electrofisiológico típico, utilice un microscopio vertical equipado con contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) y un objetivo de inmersión en agua de alta resolución, una cámara CCD/CMOS, un amplificador de pinza de parche, un soporte de micropipeta y un micromanipulador que permita un ajuste fino de la posición de la pipeta. También se necesita una platina XY para mover el microscopio.
- Monte todo el equipo en una mesa de aislamiento de vibraciones rodeada por una jaula de Faraday. Conecte un monitor de vídeo a la cámara de vídeo para observar las neuronas y visualizar las micropipetas.
- Micropipetas
- Realice electrodos de registro a partir de capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de micropipetas. La resistencia típica de la pipeta oscila entre 3 y 6 MΩ cuando se llena con solución intracelular.
>2. Grabaciones de patch-clamp de celda completa
- Para llevar a cabo los registros de patch-clamp de células enteras de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG), se utilizó una solución intracelular basada en K+ para la mayoría de los casos de registro, mientras que se aplicó una solución basada en Cs+ solo para el registro de las corrientes postsinápticas inhibitorias.
- Mueva suavemente un corte de la médula espinal a la cámara de grabación y luego manténgalo con un alambre de platino en forma de U unido firmemente con hilos de nailon para una estabilidad óptima del corte. Perfundir constantemente el corte con ACSF burbujeado en RT a través de un sistema de gravedad y establecer la tasa de perfusión en 2-4 mL/min para lograr una oxigenación suficiente.
- Identifique la región de SG (una banda translúcida) utilizando una lente de microscopio de baja resolución, elija una neurona sana utilizando el objetivo de alta resolución como célula objetivo y ajústela al centro de la pantalla del monitor de vídeo.
- Llene una micropipeta con un volumen adecuado de solución intracelular basada en K+ o Cs+ según sea necesario, inserte la micropipeta en el soporte de electrodos y asegúrese de que la solución intracelular entre en contacto con el alambre de plata dentro del soporte.
- Coloque la micropipeta en el enfoque, sumérjala en el ACSF con un micromanipulador y, a continuación, aplique una presión positiva leve (~1 psi cuando se mide con un manómetro) para forzar la micropipeta a alejarla de la suciedad y los residuos.
- Mueva la micropipeta hacia la neurona objetivo de forma gradual. Libere la presión positiva una vez que la pipeta se acerque a la neurona, y se forma un hoyuelo muy pequeño en la membrana neuronal para formar un gigasello.
- Altere el potencial de retención a -70 mV, que está cerca del potencial de membrana en reposo fisiológico (RMP) de una célula. A continuación, aplique una succión transitoria y suave a la micropipeta para romper la membrana y crear una buena configuración de célula completa.
nota: Después de transferir el corte a la cámara de registro, asegure una perfusión constante durante al menos 5 minutos para eliminar los residuos en la superficie del corte. Vale la pena señalar que la capacidad de distinguir entre neuronas sanas y no saludables/muertas es de suma importancia para un buen sellado y un registro estable. Una neurona enferma/muerta tiene una apariencia hinchada o encogida, junto con un núcleo grande visible, mientras que una neurona sana se caracteriza por una forma tridimensional (3D) con una membrana brillante y lisa, y su núcleo es invisible. Para lograr una configuración de celda completa, es esencial compensar la capacitancia rápida o lenta paso a paso cuando sea necesario. A temperatura ambiente (RT), se calcula que el potencial de unión del líquido es de 15,1-15,2 milivoltios (mV) y 4,3-4,4 mV en soluciones intracelulares basadas en K+ y Cs+, respectivamente. En nuestros estudios, los datos registrados no se corrigieron por el potencial de unión líquida.
- Registros de las propiedades intrínsecas de la membrana
- Registre las propiedades de disparo: Pruebe el patrón de disparo de cada neurona en la pinza amperimétrica con una serie de pulsos de corriente despolarizante de 1 s (25-150 picoamperios (pA) con incrementos de 25 pA) a RMP. Mida el umbral, la amplitud y el ancho medio de un solo potencial de acción sin conexión.
Tabla 1: Receta para ACSF
| componente | peso molecular | Concentración (mM) | g/L |
| NaCl | 58.5 | Artículo 117 | 6.84 |
| Kcl | 74.5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2PO4·2H2O | Artículo 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | Artículo 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | Artículo 203 | 1.2 | 0.24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-Glucosa | 180 | 11 | 1.98 |
| ácido ascórbico | Artículo 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| Piruvato de sodio | 110 | número arábigo | 0.22 |
Tabla 2: Receta para una solución intracelular basada en K+
| componente | peso molecular | Concentración (mM) | mg/100 mL |
| K-gluconato | Artículo 234.2 | 130 | 3044.6 |
| Kcl | 74.5 | 5 | 37.28 |
| Na2-Fosfocreatina | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | Artículo 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | Artículo 15.7 |
Tabla 3: Receta para una solución intracelular basada en Cs+
| componente | peso molecular | Concentración (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | Artículo 228 | 92 | Ejercicio 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-Fosfocreatina | 453.38 | 10 | 453.38 |
| TEA-Cl | 165.71 | 5 | 82.86 |
| EGTA | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | Artículo 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | Artículo 15.7 |
