Registro de la actividad eléctrica cerebral en ratones que se comportan utilizando sondas de silicio lineales de vástago múltiple

Resumen

Fuente: Sauer, J., et al. Registro de oscilaciones espacialmente restringidas en el hipocampo de ratones que se comportan. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe un protocolo para implantar una sonda de silicio lineal de múltiples vástagos en el cerebro del ratón para medir los potenciales de campo local. El procedimiento consiste en asegurar la sonda a una unidad estereotáxica, colocarla con precisión sobre la región del cerebro objetivo, insertarla en el cerebro y asegurarla con cemento dental. Después de la implantación, el conjunto se protege con una carcasa. Después de la recuperación, la configuración permite registrar los potenciales de campo locales, proporcionando información sobre la actividad neuronal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparativos

1. Diseñar y construir una herramienta de inserción adecuada que lleve transitoriamente la sonda de silicona y el conector del electrodo durante el proceso de implantación. Consulte la Figura 1 para ver un ejemplo de herramienta de inserción personalizada.
2. Libere con cuidado la sonda de silicona y el conector del electrodo de su embalaje con pinzas con punta de cerámica.
3. Levante la placa de conectores y fíjela de forma segura con una abrazadera de cocodrilo unida a un soporte.
4. Con un estereoscopio, alinee la sonda con la herramienta de inserción con pinzas con punta de cerámica. Aplique una capa de ~ 2 mm de cera de parafina derretida con un cauterizador para pegar la sonda a la herramienta de inserción. Tenga cuidado de no tocar los vástagos de la sonda durante este procedimiento.
5. Fije el conector del electrodo al eje de la herramienta de inserción con cinta adhesiva estándar. Tenga en cuenta que, dependiendo del fabricante, es posible que sea necesario soldar los cables de tierra a la placa del conector del electrodo antes de la implantación. Retire el aislamiento de dos piezas cortas de alambre de cobre aislado con barniz con soldadura de estaño aplicada con un soldador (400 °C). Suelde los cables de tierra a las ranuras apropiadas en la placa del conector de electrodos.
6. Retire el aislamiento de dos piezas adicionales de alambre de cobre. Enrolle cada alambre de cobre desnudo tres veces alrededor de un tornillo de acero inoxidable (1 mm de diámetro, 2 mm de longitud). Aplique un fundente adecuado para soldar acero y suelde el alambre de cobre a la parte inferior del tapón de rosca. Asegúrese de que la mitad inferior de la rosca del tornillo permanezca libre de soldadura de estaño.
7. Utilice un multímetro estándar para verificar el contacto eléctrico entre el cable y el tornillo.
8. Desinfectar los vástagos de la sonda de silicona y los tornillos de tierra por inmersión en etanol al 70% (10 s).
9. Prepare una cubierta protectora para el implante de la sonda cortando la cabeza de una pipeta Pasteur de plástico por la mitad.

2. Cirugía de implantación

1. Esterilice los instrumentos quirúrgicos (tijeras, pinzas de punta fina, pinzas quirúrgicas) con un esterilizador de perlas calientes. Limpie todas las superficies con etanol al 70%.
2. Inducir la anestesia con isoflurano al 3% en oxígeno suministrado a ~1 L/min.
   1. Para el mantenimiento, use isoflurano al 1 - 1,5%. Tenga en cuenta que la concentración de isoflurano necesaria para lograr la tolerancia quirúrgica puede variar de un animal a otro.
   2. La tolerancia quirúrgica estable se logra cuando el animal no responde al pellizco de los dedos de los pies. Controle la frecuencia respiratoria del ratón y ajuste la concentración de isoflurano si es necesario.
   3. Aplique ungüento en los ojos del animal para evitar que se seque.
3. Monte el mouse en un marco estereotáxico insertando suavemente las barras del oído en el canal auditivo. Una vez que la cabeza del ratón esté estabilizada por las barras de las orejas, coloque una boquilla sobre el hocico para la administración continua de isoflurano. Coloque el ratón sobre una toalla o almohadilla sobre una almohadilla térmica e inyecte buprenorfina por vía subcutánea (0,05 - 0,1 mg/kg de peso corporal) para asegurar la analgesia postoperatoria.
4. Afeitar la cabeza con una afeitadora estándar y desinfectar la piel con etanol al 70%. Con unas tijeras quirúrgicas, haga una incisión en la piel a lo largo de la línea media del cráneo y abra la piel con pinzas quirúrgicas.
5. Alinee la cabeza del animal con la ayuda de una herramienta de alineación estereotáxica para nivelar bregma y lambda. Debe haber menos de 50 μm de distancia de altura entre bregma y lambda. Además, nivele la cabeza a lo largo del eje mediolateral midiendo la profundidad del bregma en la superficie del cráneo a distancias definidas izquierda y derecha (por ejemplo, 1 mm a la izquierda y a la derecha del bregma). Ajuste la inclinación de la cabeza si es necesario.
6. Limpie la cabeza con peróxido de hidrógeno al 3% y séquela con toallitas de algodón estériles.
7. Determinar la localización de la craneotomía en relación con el bregma utilizando un atlas estereotáxico adecuado.
8. Con una cabeza de perforación de 0,9 mm, taladre dos orificios para tornillos en el hueso sobre el cerebelo para colocar tornillos de tierra y de referencia. Además, son deseables de 1 a 3 orificios para anclar tornillos para estabilizar el implante. La ubicación de los tornillos de anclaje dependerá de la ubicación de la craneotomía. Para la implantación en el hipocampo, coloque tornillos de anclaje sobre la corteza frontal parietal contralateral e ipsilateral. Inserte los tornillos en el hueso con un destornillador adecuado. Tenga cuidado de no penetrar en el cerebro.
9. Realice la craneotomía adelgazando lentamente el cráneo con la fresa en un área rectangular alrededor del lado de la implantación. Humedezca frecuentemente el hueso con tampón de fosfato (PB) esterilizado. El resto del cráneo adelgazado se puede perforar y extraer suavemente con la ayuda de una aguja de inyección fina (27 G) y un par de pinzas.
10. Perfore cuidadosamente la duramadre con una aguja de inyección delgada (27 G). Forme un pequeño gancho doblando la punta de la aguja con un par de pinzas y tire de la duramadre para retirarla. Aplique PB para evitar que la superficie del cerebro se seque.
11. Monte la herramienta de inserción de electrodos en un soporte estereotáxico, ponga a cero la sonda en bregma y mueva la sonda a las coordenadas estereotáxicas sobre la craneotomía. Penetra lentamente en la superficie del cerebro. Asegúrese de que los ejes de la sonda no se doblen. Evite implantar a través de los vasos sanguíneos.
12. Baje lentamente la sonda hasta ~200 μm por encima de la profundidad deseada. Cubra la craneotomía y los vástagos de la sonda de silicona con vaselina esterilizada para su protección. Aplique cemento dental para fijar la base de la sonda al tornillo de anclaje en el cráneo.
13. Inmediatamente después de la aplicación del cemento, mueva lentamente la sonda a la profundidad objetivo. El avance de los últimos ~200 μm después de la aplicación del cemento reduce el movimiento lateral de la sonda y garantiza un daño mínimo al tejido en el área objetivo. Tenga en cuenta que el tiempo de curado del cemento utilizado puede afectar este paso del protocolo. Con el cemento de curado rápido, omita este paso e implante directamente la sonda a la profundidad objetivo para evitar daños en la sonda de silicona.
14. Después de que el cemento se haya curado, libere la sonda de la herramienta de inserción derritiendo la cera con un cauterizador.
15. Suelte la placa de conexión del dispositivo de inserción y colóquela en un lugar adecuado del cráneo con una abrazadera de cocodrilo unida al mango de inserción. En caso de implantación de la sonda en el hipocampo, coloque la placa de conexión en el hueso parietal contralateral. Fije la placa de conexión al cráneo con cemento dental.
16. Suelde los cables de tierra y de referencia de la placa de conectores a los cables conectados a los dos tornillos sobre el cerebelo.
17. Ajuste la cubierta protectora a la altura correcta y colóquela sobre la sonda de silicona. Fije la cubierta a la placa de conexión y al cráneo con cemento dental, evitando la piel alrededor del cráneo expuesto. Por lo general, no es necesario suturar la piel alrededor del sitio de implantación.

3. Recuperación después de la cirugía

1. Aplicar un tratamiento analgésico adecuado durante al menos 2 días (por ejemplo, inyecciones subcutáneas de buprenorfina cada 6 h durante el día y en el agua de bebida durante la noche combinadas con carprofeno (4 - 5 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea cada 24 h). Se recomienda un solo alojamiento para evitar daños en el implante.
2. Espere al menos una semana para la recuperación. Consulte con las pautas locales de bienestar animal.

4. Adquisición de datos

1. Registre las LFP de ratones que se mueven libremente utilizando un sistema de adquisición de datos adecuado conectado a través de un conmutador. Para adquirir LFP, utilice una frecuencia de muestreo de 1 a 5 kHz. Se requieren velocidades de muestreo más altas (20 - 30 kHz) si se van a registrar descargas de una sola unidad junto con el LFP.
2. Almacene los archivos de grabación sin procesar de los canales individuales para analizarlos sin conexión.

Resultados

Figura 1: Imagen de la herramienta de inserción. La sonda de silicona está unida a un alfiler de insecto pegado a la base de una abrazadera de cocodrilo. El eje del soporte se puede insertar en un micromanipulador estereotáxico para su implantación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Abrazadera de cocodrilo con soporte	Reichelt Elektronik	HALTER ZD-10D
Sonda de silicio	Neurotecnología de Cambridge	Serie P 32
estereoscopio	Olimpo	SZ51
Alambre de cobre con aislamiento de barniz	Bürklin Elektronik	89 F 232
Tornillos de tierra	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
flujo	Stannol	114018
Pinzas con punta de cerámica	Herramientas de Bellas Ciencias	11210-60
Cera de parafina	Sigma-Aldrich	327204
Cauterizador	Herramientas de Bellas Ciencias	18010-00
soldador	Kurtz Ersa	OIC1300
etanol	Carl Roth	9065.1
Pipetas Pasteur	Carl Roth	EA65.1
Esterilizador de calor	Herramientas de Bellas Ciencias	18000-45
Marco estereotáxico	David Kopf	Modelo 1900
Portaelectrodos estereotáxicos	David Kopf	Modelo 1900
Isoflurano	Abbvie	B506
Concentrador de oxígeno	Respironix	1020007
Buprenorfina	Indivior Reino Unido Limitada
Afeitadora eléctrica	Tondeo	Eco-XS
Almohadilla térmica	Thermolux	463265/-67
Pinzas quirúrgicas	Herramientas de Bellas Ciencias	18050-28
Peróxido de hidrógeno	Sigma-Aldrich	H1009
Toallitas de algodón estériles	Carl Roth	EH12.1
perforar	Proxxon	Micromot 230/E
Aguja de inyección 21G	B. Braun	4657527
Tampón de fosfato/solución salina tamponada con fosfato
Atlas estereotáxico	Elsevier	9.78E+12
Tijeras quirúrgicas	Herramientas de Bellas Ciencias	14094-11
Pinzas quirúrgicas	Herramientas de Bellas Ciencias	11272-40
Agujas de inyección 27G	B. Braun	4657705
vaselina
Cemento dental	Sol Médico	SuperBond T&M
Carprofeno	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Amplificador de grabación	Tecnologías Intan	C3323
Placa de adquisición USB	Tecnologías Intan	C3004
Cables de grabación	Tecnologías Intan	C3216
Conmutador eléctrico	Lentes dóricas	HRJ-OE_FC_12_HARW