Respuestas postsinápticas evocadas por la luz en neuronas de cortes de retina de ratón

Resumen

Fuente: Hellmer, C. B., et al. Grabación de respuestas postsinápticas evocadas por la luz en neuronas en preparaciones de corte de retina de ratón adaptadas a la oscuridad utilizando técnicas de fijación de parches. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra el registro de respuestas postsinápticas evocadas por la luz en una preparación de corte de tejido retiniano de ratón adaptado a la oscuridad. El corte de retina se coloca en una cámara de registro y se utiliza una pipeta de registro para establecer la continuidad eléctrica con una célula ganglionar de la retina. Se aplican pulsos de luz para generar potenciales postsinápticos excitatorios en las células ganglionares, que son registrados por la pipeta.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación de la solución experimental

1. Prepare la solución de disección de 1 día a 1 semana antes del experimento real. Utilice una solución tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) para la disección de la retina debido a su fuerte capacidad tampón a temperaturas más bajas16. Mezcle todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.0 MgCl₂, 10 HEPES, 28 glucosa. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH. Mantenga la solución en el refrigerador hasta por 1 semana.
2. La solución de grabación es el medio de Ames, que es un líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) diseñado para preparaciones de retina. Para el día del experimento, pesa el polvo de Ames (4,4 g para 500 ml de solución) en un tubo. Además, pesa NaHCO₃ (0,95 g para 500 ml de solución) y mézclalo con el polvo de Ames.
3. Prepare la solución de pipeta intracelular para los registros de pinza de parche para el día del experimento. Mezcle todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 111 K-gluconato, 1.0 CaCl₂, 10 HEPES, 1.1 ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), 10 NaCl, 1.0 MgCl₂, 5 ATP-Mg y 1.0 GTP-Na. Ajusta el pH a 7,2 con KOH. Filtre la solución de pipeta con un filtro de jeringa convencional. Haga ~500 μl de alícuotas y guárdelas en un congelador o un congelador profundo.

>2. Preparación para el Día del Experimento

1. La noche anterior al experimento, coloque un ratón en una jaula (C57BL/6J o fondo similar, de 4 a 8 semanas de edad, macho) en un espacio oscuro para que se adapte a la oscuridad durante la noche (O/N).
2. Preparación para la disección:
   1. Llene la solución de disección (100 - 200 ml) en un vaso de precipitados, colóquela sobre hielo y burbujee con oxígeno durante al menos 10 minutos.
   2. Iniciar la oxigenación de la caja oscura para el almacenamiento de la preparación de la retina.
   3. Prepare cubreobjetos de plástico con rieles de grasa para preparaciones de cortes de retina y coloque cada uno de ellos en un plato de plástico de 35 mm.
   4. Conecte una hoja de afeitar nueva a una picadora (cortadora de pañuelos).
   5. Corta una membrana de filtro en dos mitades. Esto es para cortar la retina.
   6. Alinee las herramientas de disección y transfiera las pipetas cerca del microscopio de disección. El área de trabajo debe estar bien organizada para que se pueda acceder fácilmente a cada herramienta en la oscuridad.
3. Preparación para las grabaciones de la abrazadera de parche:
   1. Disolver el polvo de Ames y NaHCO₃ en agua destilada (Ames 4,4 g y NaHCO₃ 0,95 g/500 ml ddH₂O). Burbujee el medio de Ames con oxígeno mezclado (95% de_O2 y 5% de CO₂) durante al menos 30 minutos mientras se calienta a un nivel de temperatura récord (~35 °C). Ajuste el pH a 7,4 con NaHCO₃ mientras sigue burbujeando.
   2. Descongele la solución de pipeta interna durante la disección. Después de descongelarlo, agregue sulforrodamina B al 0,01% para la tinción intracelular.

>3. Grabaciones de pinzas de parche de la preparación de cortes de retina

1. Preparación de la grabación:
   1. Prepare los tubos de perfusión con el medio de Ames. Permita que pasen todas las burbujas al llenar el tubo.
   2. Hacer pipetas de grabación con abrazadera de parche con un extractor. Para llenar una pipeta con la solución de pipeta, sumérjala en la parte posterior de una pipeta durante 1 minuto hasta que la punta de la pipeta se llene. A continuación, llene ~1/3 de la pipeta con un relleno de micropipetas. Guarde cada pipeta en una caja de pipetas húmeda.
   3. Encienda el equipo para las grabaciones de la pinza de parche, incluida la computadora, el amplificador, la cámara del dispositivo de carga acoplada (CCD) y el microscopio.
2. Apague la luz de la habitación. Coloque una preparación de corte de retina en la cámara de la platina del microscopio utilizando un visor de infrarrojos. Una vez inmovilizado, comience la perfusión continua. Ajuste la temperatura de perfusión entre 33 y 37 °C.
3. Visualice la superficie de corte con la cámara CCD. Concéntrese en la ubicación de destino donde residen los tipos de células de destino. Seleccione una celda de aspecto saludable para el registro de la pinza de parche (es decir, debe tener una superficie de aspecto liso y una buena forma de celda).
4. Coloque una pipeta de grabación en un soporte para pipetas. Avance la pipeta a la preparación de la loncha. Cuando esté cerca de la preparación de la loncha (~2 mm por encima), busque la punta de la pipeta con el microscopio. Una vez que la punta de la pipeta sea visible bajo el microscopio, muévala hacia abajo, hacia la célula objetivo.
5. Ajuste el amplificador. Ajuste la pipeta a 0 mV/0 pA (puesta a cero) e inicie un pulso eléctrico continuo de ~5 mV a ~10 Hz. Compruebe la resistencia de la pipeta; La resistencia ideal está entre 5 y 10 MΩ para la mayoría de las neuronas de la retina.
6. Empieza a soplar desde la punta. Use una boquilla o una jeringa para aplicar presión positiva cuando la pipeta se sumerja en la solución de baño. Sople continuamente la solución interna hasta que la punta esté en la superficie de la célula objetivo.
   1. Cuando la presión positiva haga un pequeño hoyuelo en la superficie de la celda, avance ligeramente la punta y deje de soplar. Compruebe la resistencia de la pipeta, que debería aumentar. Si está aumentando continuamente, déjelo y controle la resistencia hasta que alcance >1 GΩ (gigaseal). Si la resistencia no aumenta espontáneamente, aplique suavemente presión negativa hasta que se convierta en un gigaseal.
7. Una vez alcanzado el gigaseal, cambie el potencial de retención a -70 mV. A continuación, aplique presión negativa de forma intermitente para romper la membrana dentro de la punta de la pipeta. Cuando se realiza la configuración de celda completa, la resistencia de la pipeta puede estar entre 500 MΩ y 1 GΩ, y se ve la corriente capacitiva. A veces se pueden observar corrientes postsinápticas espontáneas.
8. Registre la relación corriente-voltaje (I-V) de -80 a +40 mV. Se activan diferentes tipos de canales dependientes de voltaje según el tipo de celda.
9. Registre las corrientes sinápticas o los voltajes evocados por la luz.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones (28-60 días de edad, machos)	Laboratorio Jackson	Cepa C57BL/6J
Polvo medio de Ames	sigma	A1420	Excelente
Visor de infrarrojos	Óptica Night Owl	NOBG1	Muestra una vista brillante. Enfocar objetos pequeños es un problema.
Visores de bolsillo infrarrojos	B.E. Meyers	Visor de bolsillo OWL Gen 3 NV	Excelente vista
Tirador	Sutter	P-1000	Excelente. Fabrica pipetas de tamaño uniforme.
Caja oscura	pelícano	Caja oscura	Excelente
Sistema de abrazadera de parche	Scientifica	Ámbito de segmentación 2000	Excelente configuración. La mayoría de los componentes clave están incluidos en un paquete. Los micromanipuladores son excelentes.
amplificador	Dispositivos moleculares	abrazadera múltiple 700B	Excelente y fácil control.
Adquisición de software	Dispositivos moleculares	Software pClamp	Excelente y fácil control.
fuente de luz (LED)	LED frío	Sistema pE-2 de 4 canales	Excelente
Cámara CCD	Imágenes Q	Retiga 2000	Excelente
Jaula de Faraday	hecho a mano