Implante subdural de un array de electrocorticografía blanda para el registro de electrofisiología cortical en minipigs

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Implantación quirúrgica de matrices de electrocorticografía blanda (ECoG)

1. anestesia
   1. Premedicación: Aislar las minipigs hembras de Göttingen (n = 7) a los 2-6 meses de edad (5-8 kg) y ayunar durante la noche. Inyectar una mezcla de midazolam a 0,75 mg/kg, atropina a 0,25 μg/kg y haldol a 0,1 mg/kg por vía intradérmica, y esperar hasta que el animal esté sedado. Pesa al animal antes de continuar.
   2. Instalación de electrodo intravenoso (IV):
      1. Coloque al animal en la mesa de cirugía sobre una almohadilla térmica. Inducir la anestesia colocando una mascarilla en el animal, utilizando sevoflurano al 3%-3,5%.
      2. Coloque cables de electrocardiograma en el abdomen, un sensor de saturación de sangre en la cola y un sensor de temperatura en la fosa nasal.
      3. Coloque un cable intravenoso en una vena del oído y confirme el acceso a la sangre con una jeringa llena de solución salina. Asegúrese de que los ojos se mantengan hidratados mediante el uso de ungüento.
   3. Intubación: Inyectar un bolo de atracurio a 0,5 mg/kg, ketamina a 1 mg/kg y fentanilo a 1-2 μg/kg. Coloque al animal boca arriba para la intubación. Inserta un tubo de 4,5 mm.
   4. Medicación: Después de la intubación, suspender la anestesia con sevoflurano e instalar una infusión de propofol a 10 mg/kg/h, fentanilo a 2 μg/kg/h, atracurio a 0,2-0,5 mg/kg/h y solución salina a 4-7 mg/kg/h. Iniciar una infusión de manitol a 1 g/kg/h para reducir la inflamación cerebral durante la cirugía
      NOTA: Se puede utilizar un régimen de analgesia multimodal si lo recomienda el comité de ética animal local.
2. Campo aséptico y preparación de la piel: Afeitar toda la superficie de la cabeza más allá del campo quirúrgico. Con una almohadilla estéril, frote bien la cabeza con betadine. A continuación, coloque paños estériles en la mesa de instrumentación y en el animal para revelar solo la ventana quirúrgica. Por último, vuelva a frotar la cabeza con una almohadilla estéril con betadine.
3. Craneotomía y durotomía
   1. Corte en la piel: Incida la piel con un bisturí a lo largo de la línea media. Separe el músculo y el periostio (25 mm lateralmente desde el bregma en ambos lados y 40 mm anterior y posterior hasta el bregma) del hueso con un raspador y coloque separadores para obtener un acceso óptimo para la perforación posterior.
   2. Medidas y marcaje: Identifique bregma y lambda y márquelos con una pluma quirúrgica estéril (Figura 1A, B). Con una regla estéril, defina el contorno del colgajo óseo centrado alrededor del objetivo de implantación en ambos hemisferios. En este caso específico, se eligió la corteza auditiva, con coordenadas de -5 mm a -15 mm del bregma y de -4 mm a -20 mm lateralmente. A continuación, ajuste la craneotomía al tamaño del implante y a los puntos de referencia anatómicos, limitando el tamaño de la abertura.
   3. craneotomía:
      1. Con un taladro de hueso con una broca redonda, perfore el contorno de la craneotomía, teniendo en cuenta el grosor del cráneo. Riegue el lugar de perforación con solución salina para evitar el sobrecalentamiento del hueso.
      2. Taladre con cuidado el contorno de manera homogénea hasta llegar a la duramadre. En el primer avance, termine de perforar el contorno hasta que se haya adelgazado lo suficiente como para casi romperse. Luego, use una espátula plana (ya sea en la línea media o en el lado lateral) para romper el colgajo óseo en una sola pieza, usando el borde de la craneotomía como palanca. Si se encuentra demasiada resistencia, continúe adelgazando el hueso.
      3. Coloque la pieza de hueso en solución salina estéril.
      4. Una vez que se haya retirado el colgajo óseo, corte con cuidado el borde de la craneotomía, usando un Kerison para evitar que el borde afilado del hueso corte la duramadre.
      5. Si se encuentra un sangrado excesivo en la duramadre o el hueso, use Gelfoam o cera de hueso, respectivamente. Coloque una compresa húmeda (almohadilla estándar en solución salina estéril) en la craneotomía y repita este paso en el otro hemisferio (Figura 1B).
   4. Durotomía:
      1. Con la aguja de un kit de sutura 6-0, perfore y levante con cuidado la duramadre en el extremo anterior o posterior de la craneotomía a medio camino entre el lado medial y lateral y cree el comienzo de una incisión con el bisturí de apuñalamiento.
      2. A continuación, utilizando una pequeña espátula plana insertada en el espacio subdural que actúa como base de corte para proteger la corteza, cree una hendidura anteroposterior en la duramadre avanzando simultáneamente con ambas herramientas. Asegúrese de que la hendidura sea ligeramente más grande que el ancho del implante (Figura 1C). Si se produce algún sangrado o daño en este paso, cúbralo con espuma de gel y espere hasta que se detenga.
         NOTA: La trayectoria de la hendidura debe adaptarse si hay vasos sanguíneos grandes en la duramadre para evitar el sangrado.
4. implantación
   1. Inserción del dispositivo:
      1. Irrigar el implante (Figura 2A) con solución salina en ambos lados para que se deslice más fácilmente en el espacio subdural. Coloque el implante por encima de la hendidura de la duramadre y, con pinzas pequeñas, inserte subduralmente el dispositivo deslizándolo secuencialmente en cada borde.
      2. Sujete con cuidado el extremo del pedestal del dispositivo y avance con el implante para no crear tensión que dificulte la inserción. Cuando el borde del conector esté ubicado en la parte superior de la ranura, detenga la inserción.
   2. Asegure el implante: Para asegurar el implante en su lugar, coloque un puente de titanio sobre el cable después del borde de la craneotomía o en las alas de anclaje y asegúrelo con uno o dos tornillos de titanio utilizando el destornillador adecuado (Figura 1D).
   3. Colocación en el suelo: Retire con cuidado 1 cm del aislamiento de los cables de tierra e insértelo por vía epidural en el extremo posterior de la craneotomía (o cualquier ubicación epidural lejos de la corteza de interés o de los vasos sanguíneos grandes) (alambre en la Figura 1E)
   4. Repita los pasos en el hemisferio contralateral.
   5. Cierre de duramadre: Sutura la duramadre cuidadosamente alrededor del cable del implante utilizando una sutura reabsorbible 3-0 y un pequeño portaagujas. Junte los dos bordes de la duramadre tanto como sea posible sin rasgar la membrana delgada con el alambre de sutura (Figura 1D, E).
   6. Colocación de colgajo óseo: Fije un puente de titanio en la parte anterior y posterior de cada colgajo óseo con un tornillo de titanio. Tenga cuidado de planificar la posición de los puentes Ti con respecto a la colocación de las patas del reposapiés en los siguientes pasos. Atornille el extremo de los puentes de titanio al cráneo (Figura 1F, G).
5. Colocación del pedestal y del reposapiés
   1. Posicionamiento: En esta configuración, el reposapiés tiene seis patas con dos orificios para tornillos cada una (Figura 2B). Planifique la colocación del reposapiés en el cráneo para optimizar la ubicación de los tornillos (evite colocarlos en el borde de la craneotomía o en el músculo temporal). Omita los agujeros en las patas si no se pueden atornillar.
   2. Fijación de la placa de pie: Atornille los tornillos de titanio de la plataforma de pie hasta que esté firmemente en su lugar (consulte la Figura 1H).
   3. Colocación del pedestal: Retire los puentes de titanio sobre los cables de conexión y voltee el pedestal para aterrizar en el reposapiés. Atornille el pedestal al reposapiés. Verifique que el pedestal esté firmemente en su lugar (Figura 1I).
6. Sutura y cierre
   1. Limpieza de la herida: Limpie el espacio subcutáneo de cualquier hueso u otros desechos enjuagando con solución salina. Corta un poco de piel alrededor de los bordes del pedestal para crear un borde redondo siguiendo el cilindro.
   2. Suturas subcutáneas: Retire los separadores y doble los colgajos de piel juntos. Cree suturas subcutáneas con un alambre de sutura 4-0 no reabsorbible, a 3 mm de distancia, utilizando suturas interrumpidas simples o suturas continuas simples. Comience alejándose del pedestal, moviéndose hacia él a ambos lados de la incisión.
   3. Suturas dérmicas: Suturar la piel con un alambre de sutura 6-0 no reabsorbible, con suturas separadas 5 mm. Comience alejándose del pedestal, moviéndose hacia él a ambos lados de la incisión. Tenga cuidado de lograr una buena aposición del tejido entre los dos colgajos de piel y cerca del borde del pedestal para evitar un vacío (Figura 1J).
   4. Apósito para heridas: Limpie nuevamente el área de la herida con una almohadilla estéril y betadine. Aplique un vendaje estéril autoadhesivo sobre la herida.
7. Despertar: Después de que se hayan realizado todas las mediciones, retire al animal de todos los anestésicos, pero manténgalo bajo ventilación. Para la analgesia, aplicar un parche de buprenorfina (25 mg/h) durante 24 h. Coloque al animal en una almohadilla térmica cubierta con cortinas para acelerar la hora de despertarse. Cuando se recupere la respiración espontánea, extubar al animal y colocarlo bajo una mascarilla de oxígeno hasta que se recupere la conciencia (lo que puede tardar de 1 a 4 h).
8. Cuidados postoperatorios del animal: Durante 5 días, mantener al animal bajo estrecha vigilancia. Administrar una dosis de cefalexina de 75 mg dos veces al día con alimentos, separados de los demás animales. Lleve a cabo la desinfección de la herida diariamente aplicando grandes cantidades de betadine con almohadillas estériles empapadas (es mejor hacerlo durante la alimentación)
   nota: Cuidados a largo plazo y alojamiento: El animal operado se mantiene aislado durante 24 h. Se le devuelve a su grupo social original si el animal está lo suficientemente bien como para interactuar socialmente con sus compañeros. Es necesario realizar una observación diaria del pedestal y la abertura de la piel para seguir la integración del dispositivo en la cabeza. Cuando sea apropiado, limpie la ubicación alrededor del pedestal con grandes cantidades de betadine.

>2. Registro electrofisiológico

1. Actividad espontánea: Conecte el sistema de grabación inalámbrico a través del pedestal y registre la actividad de referencia durante 2-3 minutos. Estas grabaciones servirán como control para analizar los potenciales evocados auditivos.
2. Potenciales evocados auditivos: Además del sistema inalámbrico, inserte altavoces en un campo cerrado en los oídos de los animales. Estimulación acústica en ráfagas de tonos de reproducción a diferentes frecuencias (que van desde 200-20.000 Hz) a un nivel de presión sonora (SPL) de alrededor de 70 dB durante 120 repeticiones. Luego, promedie las grabaciones y alinéelas durante el período de estímulo para el análisis.
3. Potenciales evocados sensoriales: Coloque las agujas en el hocico en tres posiciones diferentes. Evoque potenciales sensoriales estimulando el hocico durante ~30 s con el generador de pulsos a diferentes amplitudes para obtener las curvas de reclutamiento.

3. Grabación en movimiento libre

1. Siga el mismo procedimiento descrito en la sección 2 para registrar las señales de vigilia del cerebro. Conecte el headstage inalámbrico sosteniendo al animal en los brazos del experimentador o alimentándolo con golosinas para distraerlo. Proporcionar la estimulación acústica mediante altavoces externos colocados cerca del animal.

Figura 1: Implante mínimamente invasivo de ECoG blando en el cerebro.(A) Acceso quirúrgico al cráneo, con indicación de bregma. (B) Craneotomía bilateral con duramadre visible. (C) Durotomía de hendidura en el primer hemisferio. (D) Implante subdural de ECoG blando y cierre de duramadre. (E) Durotomía de hendidura en el segundo hemisferio. Fijación del colgajo óseo en el primer hemisferio mediante puentes de titanio. (F) Implantación de ECoG blanda en el segundo hemisferio y cierre de la duramadre. (G) Fijación del colgajo óseo en el segundo hemisferio. (H) Posición de la plataforma del pie en el cráneo. (I) Fijación del pedestal en el reposapiés. (J) Cierre de piel alrededor de la base del pedestal.

Figura 2: Pedestal compatible con resonancia magnética. (A) Sistema de conexión transdérmica crónica compatible con resonancia magnética (pedestal) para acceder a la guía de electrodos blandos. (B) Pedestal con electrodos montados en el reposapiés para el anclaje del cráneo. Recuadro: Detalles del reposapiés.