Registro del potencial de campo local en cortes de corteza hipocampal-entorrinal de ratón

Resumen

Fuente: Whitebirch, A. C. Cutting agudo del cerebro del ratón para investigar la actividad espontánea de la red del hipocampo. J. Vis. Exp. (2020)

El video muestra un procedimiento para registrar el potencial de campo local (LFP) en cortes de corteza hipocampal-entorrinal de ratón. La estimulación eléctrica se proporciona en el estrato radial CA3 del hipocampo, lo que provoca cambios en el potencial postsináptico en el estrato piramidal CA1. Se registra el cambio combinado en el potencial de membrana de las neuronas CA1, denominado potencial de campo local.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Perfusión transcárdica

1. Suspenda una jeringa de 60 ml de capacidad como depósito para la solución de corte con sacarosa aproximadamente a 18 pulgadas por encima de la mesa de trabajo (por ejemplo, usando una abrazadera giratoria de tres puntas en un poste vertical). Conecte el tubo al fondo del depósito, pase el tubo a través de una abrazadera de rodillo y conecte el otro extremo del tubo a una aguja limpia de 20 G.
2. Llene el depósito de 60 mL con aproximadamente 30 mL de solución de sacarosa enfriada y dirija una línea de carbógeno hacia el depósito de sacarosa para burbujear continuamente la perfusión.
   nota: Asegúrese de que la sacarosa fluya a través del tubo y la aguja sin que queden burbujas atrapadas. El caudal debe ser lo suficientemente rápido como para tener un flujo constante y continuo de sacarosa que gotea de la aguja.
3. Con una licuadora, triture y mezcle la sacarosa congelada hasta convertirla en una suspensión helada y use la espátula / cuchara grande para distribuir la suspensión.
   1. Coloque una pequeña cantidad de lechada de sacarosa alrededor de los bordes de la tapa de la placa de Petri de vidrio. Agregue una pequeña cantidad de lechada de sacarosa al fondo de la placa de Petri.
   2. Agregue aproximadamente 20-30 mL de suscama al depósito de fluido de perfusión, mezclándola bien con los 30 mL de sacarosa líquida enfriada hasta que el depósito contenga una mezcla de sacarosa muy fría, predominantemente líquida, con alguna solución congelada remanente.
4. Coloque el mouse en una cámara conectada a un vaporizador de isoflurano. Con el oxígeno fluyendo a aproximadamente 2 L/min, gire el dial del vaporizador para suministrar isoflurano a una concentración del 5% e inicie un temporizador.
   nota: Mantenga este temporizador en marcha durante todo el curso del corte para medir qué tan rápido se obtienen las rodajas. El procedimiento debe realizarse lo más rápidamente posible, de modo que el corte esté completo y el tejido se recupere en la cámara de interfaz dentro de los 15 a 20 minutos posteriores a la entrada del animal en la cámara de isoflurano. Observe el ratón para asegurarse de que se logra un estado de anestesia profunda. Después de un mínimo de 5 minutos, el ratón debe estar profundamente anestesiado y no responder a los pellizcos de los dedos de los pies.
5. Inmediatamente antes de retirar el ratón de la cámara de isoflurano, llene la tapa de la placa de Petri con solución de sacarosa fría hasta una profundidad de aproximadamente 3-5 mm y llene el fondo de la placa de Petri con solución de sacarosa enfriada hasta una profundidad de aproximadamente 1,0 cm.
6. Transfiera rápidamente el mouse a la almohadilla absorbente izquierda y use los 3 trozos de cinta para asegurar las extremidades delanteras y la cola. Realice un pellizco en la extremidad trasera para asegurarse de que el ratón no responda antes de realizar cualquier incisión. Con las pinzas de tejido grande y las tijeras quirúrgicas, cubra la piel y haga una incisión longitudinal desde la parte inferior del esternón hasta la parte superior del pecho. Con las pinzas, tire hacia arriba del esternón y use las tijeras para cortar el diafragma.
   nota: La posición inicial del ratón y las primeras incisiones para cortar el diafragma deben realizarse lo más rápidamente posible para garantizar que el ratón no recupere la conciencia. Para garantizar una profundidad adecuada de anestesia durante todo el procedimiento, se puede colocar un cono de nariz en el ratón para administrar isoflurano durante la perfusión.
7. Use las tijeras para cortar la caja torácica a cada lado, cortando con un gran movimiento hacia el punto donde la extremidad delantera se encuentra con el cuerpo. Con las pinzas, balancee la parte delantera de la caja torácica hacia afuera y hacia la cabeza, y luego retírela por completo con un corte horizontal con unas tijeras grandes. Sostenga el corazón en su lugar con las pinzas grandes e inserte la aguja de perfusión de 20 G en el ventrículo izquierdo. Una vez que la aguja se coloca correctamente, el lado izquierdo del corazón debería palidecer rápidamente a medida que la solución de sacarosa fría llena el ventrículo.
8. Use las tijeras de disector pequeñas para cortar la aurícula derecha y permitir que la sangre fluya fuera del sistema circulatorio. Si las incisiones se realizan correctamente, debería haber un daño mínimo al corazón y debería continuar bombeando durante toda la perfusión.
   nota: Se pueden usar pedazos de papel de seda enrollados para absorber la sangre y la solución de sacarosa del corazón y mantener la visibilidad de la aguja de perfusión durante el procedimiento.
9. Asegúrese de que la aguja de perfusión permanezca en su lugar y no se salga del ventrículo izquierdo. Con un caudal y una ubicación adecuados, el hígado comenzará a palidecer a un color bronceado claro/beige entre 20 y 30 s.
10. Después de 30 a 45 segundos, use las tijeras grandes para decapitar al ratón. Sosteniendo la cabeza con la mano izquierda, empuje o pele la piel para separarla del cráneo. En un animal bien perfundido, el cráneo debe ser muy pálido y el cerebro debe aparecer de un color rosa muy claro (cercano al blanco) a través del cráneo sin vasos sanguíneos claramente visibles.

>2. Extraer el cerebro y cortar rodajas

1. Con las tijeras Bonn pequeñas, haz dos cortes laterales a través del cráneo hacia la línea media en la parte delantera del cráneo, cerca de los ojos. Haz dos cortes adicionales a cada lado de la base del cráneo.
2. Transfiera la cabeza al fondo de la placa de Petri de vidrio, donde debe sumergirse en su mayor parte en una solución de sacarosa fría. Use las tijeras pequeñas Bonn para cortar la línea media a lo largo del cráneo, tirando hacia arriba con las tijeras para minimizar el daño al tejido cerebral subyacente. Con las pinzas de tejido pequeño, agarre firmemente cada lado del cráneo y gírelo hacia arriba y lejos del cerebro, como si abriera un libro.
3. Use los dedos de la mano izquierda para mantener abiertas las solapas del cráneo e inserte la microespátula debajo del cerebro cerca de los bulbos olfativos. Voltee el cerebro del cráneo hacia la sacarosa y use la microespátula para cortar el tronco encefálico. Lave el cerebro para eliminar cualquier residuo de sangre, pelaje u otros tejidos.
4. Use la espátula / cuchara grande para transferir el cerebro a la tapa de la placa de Petri de vidrio. Con la otra mitad de la hoja de afeitar de doble filo previamente apartada, haga dos cortes coronales para extirpar primero el cerebelo y luego la porción más anterior del cerebro, incluidos los bulbos olfativos (Figura 1).
5. Aplique adhesivo de cianoacrilato a la rampa de agar. Coloque muy brevemente el cerebro sobre un trozo de papel de filtro seco utilizando las pinzas de tejido grande y luego transfiéralo inmediatamente a la rampa de agar, colocando la superficie ventral del cerebro sobre el adhesivo><. nota: Para los cortes del hipocampo intermedio, el cerebro debe estar orientado con la parte anterior mirando hacia arriba en la pendiente de la rampa, y la parte posterior más cerca de la hoja. Para los cortes del hipocampo ventral, oriente el cerebro con el extremo anterior apuntando hacia abajo en la pendiente de la rampa, con el extremo posterior en la parte superior de la rampa, más lejos de la hoja. En cualquier caso, el cerebro debe colocarse en la parte superior de la rampa, de modo que la superficie cortada coronalmente del cerebro entre en contacto con el bloque de respaldo de agar (Figura 1).
6. Coloque la plataforma de corte con el agar y el cerebro en la cámara de corte del micrótomo y sumérjala completamente con una solución de sacarosa fría. Use la espátula / cuchara grande para transferir un poco de lechada de sacarosa a la cámara, revolviendo para derretir la sacarosa congelada y bajar rápidamente la temperatura de la mezcla a ~ 1-2 ° C.
   nota: Observe el medidor de temperatura durante todo el corte. Si la solución de sacarosa se calienta por encima de 3 °C, agregue más lechada y mezcle para volver a bajar la temperatura.
7. Corte rodajas con un grosor de 450 μm con la velocidad del micrótomo ajustada a 0,07 mm/s. A medida que se libera cada corte, use las pinzas de tejido pequeño y un bisturí afilado para separar primero los dos hemisferios y luego cortar el tejido hasta que el corte consista principalmente en las regiones del hipocampo y el parahipocampo (Figura 1).
8. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para transferir las rodajas individualmente a la cámara de recuperación de la interfaz, asegurándose de que estén colocadas en la interfaz de la ACSF y el aire con solo un menisco delgado de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que cubra las rodajas. Cierre herméticamente la tapa de la cámara y deje que las lonchas se recuperen a 32 °C durante 30 minutos.
9. Después de la recuperación inicial a 32 °C, saque la cámara de recuperación de la interfaz del baño de agua y colóquela en un agitador ajustado a una velocidad lenta de modo que la barra de agitación magnética promueva la circulación de ACSF dentro de la cámara. Deje que se enfríe gradualmente a temperatura ambiente a medida que las rodajas se recuperan durante 90 minutos más. Asegúrese de que la cámara de recuperación esté continuamente burbujeada con carbógeno y no permita que queden grandes burbujas atrapadas debajo de las rodajas.

>3. Realizar registros de potencial de campo local (LFP) de actividad espontánea

1. Prepárese para las grabaciones de LFP encendiendo todo el equipo necesario, incluida la computadora que ejecuta el software de adquisición, el monitor conectado a la computadora, los estimuladores, el micromanipulador, el controlador de temperatura, la fuente de luz del microscopio, la cámara conectada al microscopio, el amplificador de microelectrodo, el digitalizador y la bomba peristáltica. Si utiliza un sistema de vacío central, abra la válvula de pared para preparar la línea de vacío que eliminará el ACSF de la cámara de registro.
2. Llene el depósito calentado con ACSF, luego coloque un extremo del tubo en el vaso de precipitados de 400 ml que contiene el ACSF burbujeante. Encienda la bomba peristáltica para dirigir el ACSF desde el vaso de precipitados de 400 ml hasta el depósito calentado y desde el depósito hasta la cámara de registro. Golpee o pellizque el tubo para liberar las burbujas atrapadas.
3. Ajuste la bomba peristáltica para garantizar que el caudal de ACSF a través de la cámara de registro sea rápido (~ 8–10 mL/min). Utilice una sonda de temperatura para asegurarse de que el ACSF esté a 32 °C en el centro de la cámara de registro.
   nota: Si se suministra ACSF a la cámara de registro mediante una bomba peristáltica, un caudal elevado puede provocar una fluctuación significativa del caudal. Se pueden lograr caudales consistentes utilizando un simple amortiguador de pulsaciones que consiste en una serie de jeringas vacías integradas en el tubo (Figura 2).
4. Prepare pipetas de estimulación y registro a partir de capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de filamentos calentado. El protocolo de extracción debe configurarse para producir pipetas con una resistencia de 2-3 MOhm para electrodos de estimulación o registro de potencial de campo local.
5. Llene las pipetas de estimulación con NaCl 1 M y las pipetas de LFP con ACSF.
6. Sujete brevemente el tubo y apague la bomba para detener el flujo de ACSF. Transfiera un corte a la cámara de grabación con pinzas finas para agarrar una esquina del papel de la lente sobre el que descansa la rebanada: la rebanada se pegará al papel de la lente. Coloque el papel de la lente y córtelo en la cámara de grabación con la rebanada hacia abajo, luego "despegue" el papel de la lente dejando la rebanada sumergida en la cámara de grabación. Asegure la rebanada con un arpa.
   nota: Las arpas se pueden comprar prefabricadas o fabricadas en el laboratorio utilizando una pieza en forma de U de acero inoxidable o filamento de platino y nailon fino.
7. Coloque una pipeta de estimulación rellena de NaCl en el micromanipulador manual y avance lentamente la punta de la pipeta en la superficie del corte (por ejemplo, en la capa del estrato radial) en un ángulo de aproximadamente 30-45°. Una vez que la punta de la pipeta penetre en el tejido, avance la pipeta hacia adelante lentamente y evite realizar grandes movimientos en dirección lateral o vertical que puedan dañar innecesariamente los axones dentro del corte. Coloque la punta de la pipeta a una profundidad mínima de 50-100 μm en la rebanada para evitar las células cercanas a la superficie que se dañaron durante el corte.
8. Coloque una pipeta LFP rellena de ACSF en el soporte de pipetas conectado al micromanipulador motorizado. Aplique una presión positiva muy ligera utilizando presión bucal o una jeringa de 1 ml conectada a través de una válvula de llave de paso y un tramo corto de tubo al soporte de pipetas.
   nota: Coloque las pipetas LFP dentro del corte para registrar las señales de interés: en el caso de ondulaciones de onda agudas, se debe colocar una pipeta LFP en el estrato piramidal (SP) y una segunda pipeta en el estrato radial (SR). Esta configuración permite registros simultáneos de la onda aguda negativa en el SR y la oscilación de ondulación de alta frecuencia en el SP (Figura 3).
9. Con el micromanipulador, avance lentamente la punta de la pipeta LFP hacia la región de interés (por ejemplo, la capa de células piramidales CA1) en un ángulo de aproximadamente 30-45°. Coloque la punta de la pipeta a una profundidad mínima de 50-100 μm en la rebanada para evitar las células cercanas a la superficie que se dañaron durante el corte. Mientras avanza la pipeta LFP, administre continuamente un pequeño pulso de prueba de voltaje utilizando el software de adquisición y observe un aumento repentino en la resistencia del electrodo. Esto puede indicar que la pipeta se ha obstruido o presionado contra una célula.
10. Una vez que la pipeta LFP esté colocada en la región de interés, libere con cuidado la presión positiva abriendo la válvula en el tubo conectado al soporte de pipeta.
11. Para registrar el LFP en una segunda ubicación simultáneamente, repita los pasos 6.8 a 6.10 con una segunda pipeta y un micromanipulador.
12. Utilice el amplificador de microelectrodo en la configuración de pinza amperimétrica para registrar la actividad espontánea en el potencial de campo local después de usar la función de equilibrio de puente en el software de adquisición para corregir la resistencia en serie de la pipeta. Las ondulaciones espontáneas de onda aguda (ROE) aparecerán como deflexiones positivas en el potencial extracelular de la capa SP (Figura 3).
13. Para registrar los potenciales de campo evocados, utilice los estimuladores conectados al digitalizador para suministrar un pulso de voltaje cuadrado corto (200 us) a través de la pipeta de estimulación llena de NaCl. Ajuste el dial de voltaje de estimulación para evocar un rango de amplitudes de respuesta.

Resultados

Figura 1: Preparación de cortes de corteza hipocampal-entorrinal (HEC) en ángulo horizontal. (A)(i) Después de extraer el cerebro, realice dos cortes coronales con una cuchilla de afeitar para extirpar las porciones posterior y anterior del cerebro. (ii) La rampa de agar está formada por dos porciones en ángulo pegadas a la plataforma de corte del mi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soporte de incubación de cortes de cerebro agudos	Intercambio de impresión 3D de los NIH	3DPX-001623	Diseñado por ChiaMing Lee, disponible en https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosina 5′-trifosfato sal de magnesio	Sigma Aldrich	A9187-500MG
Pellets molidos de Ag-Cl	Warner	64-1309, (E205)
agar-agar	Becton, Dickinson	214530-500g
ácido ascórbico	Alfa Aesar	36237
vaso de precipitados (250 mL)	Kimax	14000-250
vaso de precipitados (400 mL)	Kimax	14000-400
Biocitina	Sigma Aldrich	B4261
batidora	Oster	BRLY07-B00-NP0
Tijeras Bonn, pequeñas	becton, Dickinson	14184-09
Capilares de vidrio de borosilicato con filamento (diámetro exterior 1,5 mm, diámetro interior 0,86 mm, longitud 10 cm)	Instrumentos Sutter	BF150-86-10HP	Son preferibles los capilares pulidos al fuego.
solución de cloruro de calcio (1 M)	G-Biociencias	R040
cámara	Olimpo	OLY-150
gas carbógeno comprimido (95% de oxígeno / 5% de dióxido de carbono)	Gases aéreos	X02OX95C2003102
Oxígeno comprimido	Gases aéreos	OX 200
Estimulador aislado de voltaje constante	Digitimer Ltd.	DS2A-Mk.II
cubreobjetos (22x50 mm)	VWR	16004-314
adhesivo de cianoacrilato	Pegamento Krazy	KG925	Lo ideal es utilizar la forma con pincel para mayor precisión
Software de adquisición de datos	Axógrafo	N/A	Cualquier software equivalente (por ejemplo, pClamp) funcionaría.
Estación de trabajo en torre Dell Precision T1500 para computadoras de escritorio	Dell	N/A	El número de catálogo dependerá de la computadora específica: cualquier computadora funcionará siempre que pueda ejecutar software de adquisición de electrofisiología.
Digidata 1440A	Dispositivos moleculares	Llame al 1-2950-0367
Temporizador digital	VWR	62344-641	Temporizador trazable de 4 canales
Almohadillas absorbentes desechables	VWR	56616-018
tijeras de disector	Herramientas de Bellas Ciencias	14082-09
hojas de afeitar de doble filo	Personna	BP9020
Controlador de temperatura automático dual	Corporación Warner Instrument	TC-344B
Cámara de registro optimizada de doble superficie o flujo laminar	N/A	N/A	La cámara presentada en este protocolo está hecha a medida. Un equivalente comercial sería el RC-27L de Warner Instruments.
Bastidor de equipos	Automatiza la ciencia	FR-EQ70"	Un rack no es estrictamente necesario, pero es útil para organizar la electrofisiología
Etilenglicol-bis(2-aminoetiéter)- Ácido N,N,N',N'-teetraacético (EGTA)	Sigma Aldrich	324626-25GM
Papel de filtro	Whatman	1004 070
Escala fina	Mettler Toledo	XS204DR
Extractor de micropipetas aplanado/marrón	Instrumentos Sutter	P-97
Placa de Petri de vidrio (100 x 15 mm)	Corning	3160-101
glucosa	Fisher Científico	D16-1
Guanosina 5′-trifosfato hidrato de sal sódica	Sigma Aldrich	G8877-250MG
cubos de hielo	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
Vaporizador de isoflurano	Servicios de Anestesia General	Tec 3
cinta de laboratorio	Fisher Científico	15-901-10R
Papel para lentes	Fisher Científico	11-996
Fuente de luz	Olimpo	TH4-100
solución de cloruro de magnesio (1 M)	Calidad Biológica	351-033-721EA
Barras de agitación magnéticas	Fisher Científico	Teléfono 14-513-56	El número de catálogo dependerá del tamaño de la barra de agitación.
Micromanipulador	Luigs & Neumann	SM-5
Micromanipulador (manual)	Scientifica	LBM-2000-00
microscopio	Olimpo	BX51WI
microespátula	Herramientas de Bellas Ciencias	10089-11
monitor	Dell	2007FPb
Amplificador de microelectrodo MultiClamp 700B	Dispositivos moleculares	ABRAZADERA MÚLTIPLE 700B	La MultiClamp 700B debe incluir cabeceras, soportes para pipetas y un modelo de celda.
N-(2-hidroxietil)piperazina-N'(ácido 2-etanosulfónico), (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375-25G
aguja (calibre 20, 1,5 pulgadas de longitud)	Becton, Dickinson	305176
filamento de nailon	YLI Wonder Hilo Invisible	212-15-004	tamaño 0.004. Este gato. # es de Amazon.com
malla de nailon	Corporación Warner Instruments	64-0198
bomba perstáltica	Aparato de Harvard	70-2027
Sal de fosfocreatina di(tris)	Sigma Aldrich	P1937-1G
Soportes para pipetas	Dispositivos moleculares	1-HL-U
Alambre de platino	Precisión mundial	PT0203
filamento de ácido poliláctico (PLA)	Ultimaker	RAL 9010
cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P3911-500G
gluconato de potasio	Sigma Aldrich	1550001-200MG
Hidróxido de potasio	Sigma Aldrich	60377-1KG
Afeitar	VWR	55411-050
abrazadera de rodillo	Instrumentos de precisión mundial	14041
escama	Mettler Toledo	PM2000
mango de bisturí	Herramientas de Bellas Ciencias	10004-13
Arpa de rebanada	Warner	SHD-26GH/2
bicarbonato de sodio	Fisher Chemical	S233-500
cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S9888-1KG
fosfato de sodio monobásico anhidro	Fisher Chemical	S369-500
piruvato de sodio	Fisher Chemical	BP356-100
espátula	VWR	82027-520
espátula/cuchara, grande	VWR	470149-442
Hojas de bisturí estériles	pluma	72044-10
agitador / placa calefactora	Corning	6795-220
Válvulas llave de paso, 1 vía	Instrumentos de precisión mundial	Año 14054
Válvulas llave de paso de 3 vías	Instrumentos de precisión mundial	Año 14036
sacarosa	Acros Organics	AC177142500
Soporte para abrazaderas giratorias	Fisher Científico	14-679Q
tijeras quirúrgicas, afiladas/desafiladas	Herramientas de Bellas Ciencias	14001-12
jeringa (1 mL)	Becton, Dickinson	309659
jeringa (60 mL con punta Luer-Lok)	Becton, Dickinson	309653
abrazadera de tres puntas	Fisher Científico	05-769-8Q
pinza de tejido, grande	Herramientas de Bellas Ciencias	11021-15
pinza de tejido, pequeña	Herramientas de Bellas Ciencias	11023-10
Pipetas de transferencia	Fisher Científico	13-711-7M
tubería	Tygon	E-3603	ID 1/16 pulgada, OD 3/16 pulgada
tubería	Tygon	R-3603	ID 1/8 de pulgada, OD 1/4 de pulgada
grasa de vacío	Dow Corning	14-635-5D
micrótomo de cuchilla vibratoria	Leica	VT 1200S
Mesa de amortiguación de vibraciones con jaula de Faraday	Micro-G / TMC-ametek	2536-516-4-30PE
matraz aforado (1 L)	Kimax	KIM-28014-1000
matraz aforado (2 L)	pyrex	65640-2000
Baño de agua tibia	VWR	Año 1209