Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Perfusión transcárdica
- Suspenda una jeringa de 60 ml de capacidad como depósito para la solución de corte con sacarosa aproximadamente a 18 pulgadas por encima de la mesa de trabajo (por ejemplo, usando una abrazadera giratoria de tres puntas en un poste vertical). Conecte el tubo al fondo del depósito, pase el tubo a través de una abrazadera de rodillo y conecte el otro extremo del tubo a una aguja limpia de 20 G.
- Llene el depósito de 60 mL con aproximadamente 30 mL de solución de sacarosa enfriada y dirija una línea de carbógeno hacia el depósito de sacarosa para burbujear continuamente la perfusión.
nota: Asegúrese de que la sacarosa fluya a través del tubo y la aguja sin que queden burbujas atrapadas. El caudal debe ser lo suficientemente rápido como para tener un flujo constante y continuo de sacarosa que gotea de la aguja.
- Con una licuadora, triture y mezcle la sacarosa congelada hasta convertirla en una suspensión helada y use la espátula / cuchara grande para distribuir la suspensión.
- Coloque una pequeña cantidad de lechada de sacarosa alrededor de los bordes de la tapa de la placa de Petri de vidrio. Agregue una pequeña cantidad de lechada de sacarosa al fondo de la placa de Petri.
- Agregue aproximadamente 20-30 mL de suscama al depósito de fluido de perfusión, mezclándola bien con los 30 mL de sacarosa líquida enfriada hasta que el depósito contenga una mezcla de sacarosa muy fría, predominantemente líquida, con alguna solución congelada remanente.
- Coloque el mouse en una cámara conectada a un vaporizador de isoflurano. Con el oxígeno fluyendo a aproximadamente 2 L/min, gire el dial del vaporizador para suministrar isoflurano a una concentración del 5% e inicie un temporizador.
nota: Mantenga este temporizador en marcha durante todo el curso del corte para medir qué tan rápido se obtienen las rodajas. El procedimiento debe realizarse lo más rápidamente posible, de modo que el corte esté completo y el tejido se recupere en la cámara de interfaz dentro de los 15 a 20 minutos posteriores a la entrada del animal en la cámara de isoflurano. Observe el ratón para asegurarse de que se logra un estado de anestesia profunda. Después de un mínimo de 5 minutos, el ratón debe estar profundamente anestesiado y no responder a los pellizcos de los dedos de los pies.
- Inmediatamente antes de retirar el ratón de la cámara de isoflurano, llene la tapa de la placa de Petri con solución de sacarosa fría hasta una profundidad de aproximadamente 3-5 mm y llene el fondo de la placa de Petri con solución de sacarosa enfriada hasta una profundidad de aproximadamente 1,0 cm.
- Transfiera rápidamente el mouse a la almohadilla absorbente izquierda y use los 3 trozos de cinta para asegurar las extremidades delanteras y la cola. Realice un pellizco en la extremidad trasera para asegurarse de que el ratón no responda antes de realizar cualquier incisión. Con las pinzas de tejido grande y las tijeras quirúrgicas, cubra la piel y haga una incisión longitudinal desde la parte inferior del esternón hasta la parte superior del pecho. Con las pinzas, tire hacia arriba del esternón y use las tijeras para cortar el diafragma.
nota: La posición inicial del ratón y las primeras incisiones para cortar el diafragma deben realizarse lo más rápidamente posible para garantizar que el ratón no recupere la conciencia. Para garantizar una profundidad adecuada de anestesia durante todo el procedimiento, se puede colocar un cono de nariz en el ratón para administrar isoflurano durante la perfusión.
- Use las tijeras para cortar la caja torácica a cada lado, cortando con un gran movimiento hacia el punto donde la extremidad delantera se encuentra con el cuerpo. Con las pinzas, balancee la parte delantera de la caja torácica hacia afuera y hacia la cabeza, y luego retírela por completo con un corte horizontal con unas tijeras grandes. Sostenga el corazón en su lugar con las pinzas grandes e inserte la aguja de perfusión de 20 G en el ventrículo izquierdo. Una vez que la aguja se coloca correctamente, el lado izquierdo del corazón debería palidecer rápidamente a medida que la solución de sacarosa fría llena el ventrículo.
- Use las tijeras de disector pequeñas para cortar la aurícula derecha y permitir que la sangre fluya fuera del sistema circulatorio. Si las incisiones se realizan correctamente, debería haber un daño mínimo al corazón y debería continuar bombeando durante toda la perfusión.
nota: Se pueden usar pedazos de papel de seda enrollados para absorber la sangre y la solución de sacarosa del corazón y mantener la visibilidad de la aguja de perfusión durante el procedimiento.
- Asegúrese de que la aguja de perfusión permanezca en su lugar y no se salga del ventrículo izquierdo. Con un caudal y una ubicación adecuados, el hígado comenzará a palidecer a un color bronceado claro/beige entre 20 y 30 s.
- Después de 30 a 45 segundos, use las tijeras grandes para decapitar al ratón. Sosteniendo la cabeza con la mano izquierda, empuje o pele la piel para separarla del cráneo. En un animal bien perfundido, el cráneo debe ser muy pálido y el cerebro debe aparecer de un color rosa muy claro (cercano al blanco) a través del cráneo sin vasos sanguíneos claramente visibles.
>2. Extraer el cerebro y cortar rodajas
- Con las tijeras Bonn pequeñas, haz dos cortes laterales a través del cráneo hacia la línea media en la parte delantera del cráneo, cerca de los ojos. Haz dos cortes adicionales a cada lado de la base del cráneo.
- Transfiera la cabeza al fondo de la placa de Petri de vidrio, donde debe sumergirse en su mayor parte en una solución de sacarosa fría. Use las tijeras pequeñas Bonn para cortar la línea media a lo largo del cráneo, tirando hacia arriba con las tijeras para minimizar el daño al tejido cerebral subyacente. Con las pinzas de tejido pequeño, agarre firmemente cada lado del cráneo y gírelo hacia arriba y lejos del cerebro, como si abriera un libro.
- Use los dedos de la mano izquierda para mantener abiertas las solapas del cráneo e inserte la microespátula debajo del cerebro cerca de los bulbos olfativos. Voltee el cerebro del cráneo hacia la sacarosa y use la microespátula para cortar el tronco encefálico. Lave el cerebro para eliminar cualquier residuo de sangre, pelaje u otros tejidos.
- Use la espátula / cuchara grande para transferir el cerebro a la tapa de la placa de Petri de vidrio. Con la otra mitad de la hoja de afeitar de doble filo previamente apartada, haga dos cortes coronales para extirpar primero el cerebelo y luego la porción más anterior del cerebro, incluidos los bulbos olfativos (Figura 1).
- Aplique adhesivo de cianoacrilato a la rampa de agar. Coloque muy brevemente el cerebro sobre un trozo de papel de filtro seco utilizando las pinzas de tejido grande y luego transfiéralo inmediatamente a la rampa de agar, colocando la superficie ventral del cerebro sobre el adhesivo><.
nota: Para los cortes del hipocampo intermedio, el cerebro debe estar orientado con la parte anterior mirando hacia arriba en la pendiente de la rampa, y la parte posterior más cerca de la hoja. Para los cortes del hipocampo ventral, oriente el cerebro con el extremo anterior apuntando hacia abajo en la pendiente de la rampa, con el extremo posterior en la parte superior de la rampa, más lejos de la hoja. En cualquier caso, el cerebro debe colocarse en la parte superior de la rampa, de modo que la superficie cortada coronalmente del cerebro entre en contacto con el bloque de respaldo de agar (Figura 1).
- Coloque la plataforma de corte con el agar y el cerebro en la cámara de corte del micrótomo y sumérjala completamente con una solución de sacarosa fría. Use la espátula / cuchara grande para transferir un poco de lechada de sacarosa a la cámara, revolviendo para derretir la sacarosa congelada y bajar rápidamente la temperatura de la mezcla a ~ 1-2 ° C.
nota: Observe el medidor de temperatura durante todo el corte. Si la solución de sacarosa se calienta por encima de 3 °C, agregue más lechada y mezcle para volver a bajar la temperatura.
- Corte rodajas con un grosor de 450 μm con la velocidad del micrótomo ajustada a 0,07 mm/s. A medida que se libera cada corte, use las pinzas de tejido pequeño y un bisturí afilado para separar primero los dos hemisferios y luego cortar el tejido hasta que el corte consista principalmente en las regiones del hipocampo y el parahipocampo (Figura 1).
- Utilice una pipeta de transferencia de plástico para transferir las rodajas individualmente a la cámara de recuperación de la interfaz, asegurándose de que estén colocadas en la interfaz de la ACSF y el aire con solo un menisco delgado de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que cubra las rodajas. Cierre herméticamente la tapa de la cámara y deje que las lonchas se recuperen a 32 °C durante 30 minutos.
- Después de la recuperación inicial a 32 °C, saque la cámara de recuperación de la interfaz del baño de agua y colóquela en un agitador ajustado a una velocidad lenta de modo que la barra de agitación magnética promueva la circulación de ACSF dentro de la cámara. Deje que se enfríe gradualmente a temperatura ambiente a medida que las rodajas se recuperan durante 90 minutos más. Asegúrese de que la cámara de recuperación esté continuamente burbujeada con carbógeno y no permita que queden grandes burbujas atrapadas debajo de las rodajas.
>3. Realizar registros de potencial de campo local (LFP) de actividad espontánea
- Prepárese para las grabaciones de LFP encendiendo todo el equipo necesario, incluida la computadora que ejecuta el software de adquisición, el monitor conectado a la computadora, los estimuladores, el micromanipulador, el controlador de temperatura, la fuente de luz del microscopio, la cámara conectada al microscopio, el amplificador de microelectrodo, el digitalizador y la bomba peristáltica. Si utiliza un sistema de vacío central, abra la válvula de pared para preparar la línea de vacío que eliminará el ACSF de la cámara de registro.
- Llene el depósito calentado con ACSF, luego coloque un extremo del tubo en el vaso de precipitados de 400 ml que contiene el ACSF burbujeante. Encienda la bomba peristáltica para dirigir el ACSF desde el vaso de precipitados de 400 ml hasta el depósito calentado y desde el depósito hasta la cámara de registro. Golpee o pellizque el tubo para liberar las burbujas atrapadas.
- Ajuste la bomba peristáltica para garantizar que el caudal de ACSF a través de la cámara de registro sea rápido (~ 8–10 mL/min). Utilice una sonda de temperatura para asegurarse de que el ACSF esté a 32 °C en el centro de la cámara de registro.
nota: Si se suministra ACSF a la cámara de registro mediante una bomba peristáltica, un caudal elevado puede provocar una fluctuación significativa del caudal. Se pueden lograr caudales consistentes utilizando un simple amortiguador de pulsaciones que consiste en una serie de jeringas vacías integradas en el tubo (Figura 2).
- Prepare pipetas de estimulación y registro a partir de capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de filamentos calentado. El protocolo de extracción debe configurarse para producir pipetas con una resistencia de 2-3 MOhm para electrodos de estimulación o registro de potencial de campo local.
- Llene las pipetas de estimulación con NaCl 1 M y las pipetas de LFP con ACSF.
- Sujete brevemente el tubo y apague la bomba para detener el flujo de ACSF. Transfiera un corte a la cámara de grabación con pinzas finas para agarrar una esquina del papel de la lente sobre el que descansa la rebanada: la rebanada se pegará al papel de la lente. Coloque el papel de la lente y córtelo en la cámara de grabación con la rebanada hacia abajo, luego "despegue" el papel de la lente dejando la rebanada sumergida en la cámara de grabación. Asegure la rebanada con un arpa.
nota: Las arpas se pueden comprar prefabricadas o fabricadas en el laboratorio utilizando una pieza en forma de U de acero inoxidable o filamento de platino y nailon fino.
- Coloque una pipeta de estimulación rellena de NaCl en el micromanipulador manual y avance lentamente la punta de la pipeta en la superficie del corte (por ejemplo, en la capa del estrato radial) en un ángulo de aproximadamente 30-45°. Una vez que la punta de la pipeta penetre en el tejido, avance la pipeta hacia adelante lentamente y evite realizar grandes movimientos en dirección lateral o vertical que puedan dañar innecesariamente los axones dentro del corte. Coloque la punta de la pipeta a una profundidad mínima de 50-100 μm en la rebanada para evitar las células cercanas a la superficie que se dañaron durante el corte.
- Coloque una pipeta LFP rellena de ACSF en el soporte de pipetas conectado al micromanipulador motorizado. Aplique una presión positiva muy ligera utilizando presión bucal o una jeringa de 1 ml conectada a través de una válvula de llave de paso y un tramo corto de tubo al soporte de pipetas.
nota: Coloque las pipetas LFP dentro del corte para registrar las señales de interés: en el caso de ondulaciones de onda agudas, se debe colocar una pipeta LFP en el estrato piramidal (SP) y una segunda pipeta en el estrato radial (SR). Esta configuración permite registros simultáneos de la onda aguda negativa en el SR y la oscilación de ondulación de alta frecuencia en el SP (Figura 3).
- Con el micromanipulador, avance lentamente la punta de la pipeta LFP hacia la región de interés (por ejemplo, la capa de células piramidales CA1) en un ángulo de aproximadamente 30-45°. Coloque la punta de la pipeta a una profundidad mínima de 50-100 μm en la rebanada para evitar las células cercanas a la superficie que se dañaron durante el corte. Mientras avanza la pipeta LFP, administre continuamente un pequeño pulso de prueba de voltaje utilizando el software de adquisición y observe un aumento repentino en la resistencia del electrodo. Esto puede indicar que la pipeta se ha obstruido o presionado contra una célula.
- Una vez que la pipeta LFP esté colocada en la región de interés, libere con cuidado la presión positiva abriendo la válvula en el tubo conectado al soporte de pipeta.
- Para registrar el LFP en una segunda ubicación simultáneamente, repita los pasos 6.8 a 6.10 con una segunda pipeta y un micromanipulador.
- Utilice el amplificador de microelectrodo en la configuración de pinza amperimétrica para registrar la actividad espontánea en el potencial de campo local después de usar la función de equilibrio de puente en el software de adquisición para corregir la resistencia en serie de la pipeta. Las ondulaciones espontáneas de onda aguda (ROE) aparecerán como deflexiones positivas en el potencial extracelular de la capa SP (Figura 3).
- Para registrar los potenciales de campo evocados, utilice los estimuladores conectados al digitalizador para suministrar un pulso de voltaje cuadrado corto (200 us) a través de la pipeta de estimulación llena de NaCl. Ajuste el dial de voltaje de estimulación para evocar un rango de amplitudes de respuesta.
