Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Configuración de grabación electrofisiológica
- Fije la piel del oído externo del ratón (pabellón auricular) a la base revestida de PDMS de una cámara de grabación con finos alfileres de insectos alrededor de los bordes (~ 6-8 por oreja), colocando los nervios limpios en la base del oído cerca de dos electrodos de succión, uno para registrar (para tomar el nervio) y el otro un electrodo indiferente (para proporcionar la señal neutra a un amplificador diferencial).
- Para el electrodo de registro, haga coincidir cuidadosamente la abertura y el diámetro interno de la abertura con el grosor combinado de los dos nervios, de modo que encajen lo más cómodamente posible y durante la mayor longitud posible.
- Introduzca los nervios en el electrodo mediante una succión suave de una jeringa de 2 ml conectada al otro extremo con un tubo de caucho de silicona. Asegúrate de que los nervios estén rectos, no doblados ni doblados.
- Desarrolle un ajuste de alta resistencia eléctrica/impedancia mediante el uso de una succión más fuerte para extraer tejido conectivo o tejido adiposo para formar un tapón que sella herméticamente la abertura alrededor del nervio.
- Llene el otro electrodo (indiferente) con solución salina por succión si es necesario (puede llenarse por capilaridad).
- Coloque hilos de registro idénticos (plata o platino) en el orificio interno de los electrodos de registro para que entren en contacto con la solución salina y el nervio (registro) o el extremo estrechado y pulido al fuego (indiferente) del electrodo. Cada electrodo se suelda individualmente a diferentes núcleos de cable apantallado de dos hilos. Coloque el electrodo de baño (tierra) (pellet de Ag/AgCl) en el baño y conéctelo a tierra a la pantalla del cable de dos hilos conectado a los electrodos de registro.
- Alimente la actividad eléctrica de los dos electrodos en los canales separados de un amplificador diferencial, filtro (paso de banda 0,2-2 kHz) y visualice en la pantalla de un osciloscopio. Compruebe que los niveles de ruido eléctrico del canal A (grabación) y del canal B (indiferente) sean similares. En esta etapa puede que no sea posible ver los potenciales de acción espontáneos normales en el canal A antes de que los dos electrodos estén equilibrados.
- Repare cualquier diferencia en el ruido de fondo entre los electrodos aumentando la impedancia de los electrodos de grabación (canal A) o indiferentes (canal B). Para ello, succione el tejido conectivo areolar (adiposo) más adentro de cualquiera de los electrodos y/o aplicando una mayor fuerza de succión en la jeringa de 50 ml.
- Una vez "equilibrado" de esta manera, vuelva a la grabación diferencial (A-B) y busque potenciales de acción espontáneos (AP) en la traza o al acariciar los pelos en el margen del pabellón auricular. Si no se observa actividad (picos), vuelva a verificar el ajuste hermético del nervio en el electrodo de registro y el tejido conectivo areolar en el electrodo indiferente: por lo general, cuanto más apretado (mayor resistencia) sea el sello y más igual sea la impedancia en los dos electrodos, mejor. Con la práctica, se logrará una relación señal:ruido de buena calidad (>2:1).
- Registre el electroneurograma a través de una interfaz de laboratorio y un software de electrofisiología que se ejecuta en una computadora. Una salida de audio de pico es muy útil y se puede lograr alimentando el neurograma a través de un amplificador de audio y un altavoz de audio asociado. Ajuste el umbral para que esté justo por encima del ruido de referencia (identificado por la ausencia de "silbido" de ruido blanco).
- Para aumentar el acceso del fármaco o del tinte fluorescente de estirílilo a las terminaciones lanceoladas, retire con cuidado la capa adiposa subdérmica cerca del margen del pabellón auricular, abriendo una ventana de ~5 mm x 5 mm, exponiendo la dermis y la base de los folículos (Figura 1A, B).
- Fije un pliegue de ~ 1 mm de piel de la oreja aclarada con tejido adiposo en el margen delantero (al nivel de la ventana recién producida, si corresponde), dejando un espacio claro lleno de solución salina entre las capas de piel apuestos. Acaricie suavemente los pelos que sobresalen a lo largo del borde doblado con un alfiler o pinzas finas conectadas a tierra, sin tocar la piel, para localizar el área de máxima salida AP en el osciloscopio y los distintivos "clics" y "chasquidos" en la salida de audio.
>2. Registro de los potenciales de acción evocados por estímulos
- Coloque la sonda de estimulación mecánica, un microelectrodo de vidrio de borosilicato de 10 cm pulido al fuego unido a un actuador piezoeléctrico cerámico, de modo que el movimiento sea paralelo al pliegue de la piel. Coloque la punta a unos 0,5-1 mm del pliegue de la piel, de modo que toque los pelos pero no la piel. Verifique la estimulación efectiva moviendo lentamente la punta de la sonda manualmente para desviar los pelos y observar/escuchar los picos.
- Utilice el software para impulsar la estimulación mecánica de 1-3 pelos (por ejemplo, 3 segundos a 5 Hz de sinusoides, cada 10 segundos de desplazamiento de la sonda 200-500 μm) y registre las respuestas evocadas por la estimulación en los nervios.
- Administre varios trenes de estimulación mecánica idénticos a intervalos de 10 segundos. Optimice la posición de la sonda para la repetibilidad, luego reduzca la frecuencia de estimulación de acuerdo con el protocolo experimental (por ejemplo, la tasa de repetición de caída de 10 segundos a 30 segundos).
- Utilice el software para discriminar la actividad similar a la AP, por ejemplo, utilizando un umbral simple establecido en ~ 2 veces la amplitud de ruido de alta frecuencia y ~ 25% de los AP más grandes.
- Cuente los AP que cruzan el umbral como "eventos", cuantificando la frecuencia y las características de los AP producidos.
>3. Registro de disparos evocados por estímulos combinados con N-(3-trietilaminopropil)-4-(4-(dibutilamino) estiril) Etiquetado de dibromuro de piridinio
- Para examinar los efectos de los colorantes de estililo en la activación aferente evocada por estímulos y el marcaje terminal, agregue la concentración adecuada de un colorante de estiril de elección a la solución de baño y continúe con el registro eléctrico.
- Después del tiempo de exposición requerido (generalmente al menos 30 minutos), prepare la preparación para ver los folículos. Despliega el colgajo de piel quitando los pasadores de retención y expone el área dérmica despejada para revelar el etiquetado terminal.
- Lave el tinte externo con solución salina sin colorante, haciendo 3 cambios completos de solución salina.
- Incubar en el cambio final de solución salina sin colorante gaseado durante 10-15 minutos para permitir que la contaminación más persistente del tinte se filtre de las membranas expuestas/externas.
- Eliminar el colorante no internalizado que queda en las membranas con un agente secuestrante (beta-ciclodextrina sulfobutilada, 1 mM, 5 min) en solución salina.
- Transfiera la cámara de registro a la platina de un microscopio de epifluorescencia vertical y conecte la cámara con el mecanismo de movimiento de la platina/portaobjetos.
- Ilumine la preparación con una luz de excitación adecuada para el tinte estirilo. Utilice un objetivo de microscopio de fluorescencia de 10X o 25X para observar el marcaje del folículo (Figura 1).
