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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de electrodos y cables para registros de EEG/EMG
- Prepare el electrodo de registro de EEG/EMG de acuerdo con el siguiente procedimiento.
nota: El electrodo es desechable y solo se puede usar para 1 animal. Planifique cuidadosamente la configuración del cableado para todos los conectores. Coloque marcas en los conectores para la orientación correcta.
- Suelde cada pin de un cabezal de 4 pines a un alambre de acero inoxidable de 2 cm. En resumen, sostenga un extremo del cable en el pasador, coloque un soldador caliente en la unión del cable y el pasador y derrita un poco de soldadura para asegurarse de que la soldadura suficiente fluya sin problemas en la unión. Tenga cuidado de no aplicar demasiado calor al alfiler; De lo contrario, el plástico alrededor de los alfileres se derretirá.
- Suelde el extremo libre de cada uno de los 2 cables unidos a la cabeza del pin a la cabeza de un tornillo de acero inoxidable de 1,0 mm de diámetro. En resumen, sostenga el extremo libre del cable a la rosca debajo de la cabeza del tornillo, coloque un soldador caliente en la unión del tornillo de alambre y derrita un poco de soldadura para asegurarse de que la soldadura suficiente entre sin problemas en la unión. Los 2 cables con tornillos sirven como electrodos de registro de EEG, mientras que los 2 cables sin tornillos sirven como electrodos de registro de EMG.
- Utilice unas tijeras para quitar 1 mm del aislamiento en el extremo de los electrodos EMG para aumentar la calidad de la señal EMG.
- Cubra completamente todas las clavijas soldadas con adhesivo epoxi utilizando un palo de madera delgado o un palillo de dientes para reducir el ruido eléctrico durante las grabaciones de EEG/EMG.
- Prepare un cable para conectar el electrodo con el anillo colector como se describe a continuación. Este cable se puede reutilizar.
- Suelde cada pin de un conector FFC/FPC de 4 pines con un cable plano de 30 cm. En resumen, sostenga el extremo pelado del cable en el pasador, coloque un soldador caliente en la unión del cable y el pasador y derrita un poco de soldadura para asegurarse de que la soldadura suficiente entre sin problemas en la unión><.
Nota: Elija la longitud del cable plano que sea apropiada para la altura de la jaula del animal de experimentación utilizada para las grabaciones de EEG/EMG.
- Suelde los zócalos de engarce a una punta de los cables en el otro extremo del cable plano. En resumen, sostenga un zócalo de engarce en el extremo libre pelado del cable, coloque un soldador caliente en la unión del zócalo y derrita un poco de soldadura para asegurarse de que la soldadura suficiente entre sin problemas en la unión.
- Inserte cada zócalo de crimpado en una carcasa de crimpado de 4 posiciones.
- Cubra completamente los zócalos de engarce con adhesivo epoxi usando un palo de madera delgado o un palillo de dientes.
>2. Implantación de electrodos en la cabeza del ratón (Duración: aprox. 20 min)
- Esterilice todas las herramientas quirúrgicas en un esterilizador de perlas calientes antes de la cirugía. Anestesiar a un ratón macho (10 a 20 semanas de edad, 20 a 30 g) con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg). Después de comprobar que el ratón está profundamente anestesiado pellizcando un dedo del pie, afeita el pelo de la cabeza y el cuello con una maquinilla.
- Mueva el ratón al marco estereotáxico y fije la cabeza entre las 2 barras de las orejas. Aplica vaselina en los ojos para prevenir la sequedad. Limpia la piel afeitada con alcohol y córtala a lo largo de la línea media con un bisturí para exponer el cráneo. Sujete la piel para mantener abierta el área quirúrgica.
- Con un cortador de carburo (tamaño de la broca: 0,8 mm de diámetro), perfore 2 orificios en el cráneo, uno sobre el área cortical frontal (1 mm anterior al bregma, 1,5 mm lateral a la línea media) y el otro sobre el área parietal (1 mm anterior a lambda, 1,5 mm lateral a la línea media) del hemisferio derecho, según las coordenadas estereotáxicas de Paxinos y Franklin.
- Con un destornillador de joyería, coloque tornillos de registro de EEG de acero inoxidable en los orificios y dé de 2 a 2,5 vueltas a cada tornillo para el posicionamiento epidural sobre la corteza><.
Nota: No inserte tornillos demasiado profundos para evitar daños en el tejido cerebral. Compruebe que los tornillos estén bien fijados en el cráneo. Esto es importante para tener señales de EEG estables durante un período prolongado de múltiples registros (por lo general, más de 1 mes). Los tornillos ondulantes producen artefactos de EEG y pueden desprenderse antes del final del programa experimental.
- Fije el conjunto de electrodos (véase la sección 1.1, clavijas hacia arriba) con pegamento instantáneo al cráneo y cúbralo con cemento dental. Haga orificios bilaterales pequeños con pinzas en los músculos trapecios (cuello) e inserte los alambres de acero inoxidable que sirven como electrodos EMG en los orificios. Sutura la piel con un hilo de seda (0,1 mm de diámetro) para evitar la exposición del músculo.
- Retire el ratón del marco estereotáxico. Administrar ampicilina (100 mg/kg) y meloxicam (1 mg/kg) por vía intraperitoneal al ratón para evitar la infección bacteriana y reducir el dolor postquirúrgico, respectivamente. Mantenga el mouse en una almohadilla térmica y vigílelo hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Aloje al ratón individualmente durante la recuperación para evitar la extracción de los electrodos por parte de otros animales y administre meloxicam (1 mg/kg) por vía intraperitoneal el primer día después de la cirugía.
>3. Registro y adquisición de datos de EEG/EMG
- Después de un período de recuperación de 1 semana, aloje a cada ratón individualmente en una jaula experimental colocada en una cámara de grabación insonorizada. Mantenga una temperatura ambiente de 23 ± 1 °C y controle automáticamente los ciclos de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad (luces encendidas a las 08:00, intensidad de iluminación ~ 100 lux).
- Conecte el conjunto de electrodos de EEG/EMG en la cabeza del mouse a un cable de grabación. Asegúrese de que el cable de grabación esté conectado a un anillo deslizante (que está diseñado para que los movimientos del ratón no se vean restringidos por la torsión del cable) y a un amplificador de señal EEG/EMG. Filtrar señales EEG/EMG (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalizar a una frecuencia de muestreo de 128 Hz mediante un convertidor de analógico a digital (A/D) y, finalmente, grabar en un ordenador con software de grabación EEG/EMG.
- Habitúe el mouse durante 2 a 3 días en la cámara de grabación.
- Posteriormente, inicie el software de registro de EEG/EMG.
- Seleccione la pestaña "Información del archivo de datos" y haga clic en la casilla junto al nombre del archivo. Ingrese un nombre de archivo y haga clic en 'Guardar'.
- Seleccione la pestaña 'Condición de grabación' y seleccione todos los canales de EEG/EMG que se registrarán.
- Seleccione la frecuencia de muestreo (128 Hz) en la pestaña 'Condición de grabación'.
- Compruebe si los canales seleccionados se muestran correctamente en la pestaña 'Información del canal'.
- Seleccione la pestaña "Configuración del temporizador" y haga clic en "Monitor" para mostrar EEG y EMG.
- Compruebe si las señales de EEG/EMG se muestran correctamente.
- Seleccione la pestaña 'Configuración del temporizador' y configure la hora del reloj para el comienzo y el final de la grabación en el área 'Temporizador principal'.
- Haga clic en 'Monitor' en la pestaña 'Configuración del temporizador' para iniciar la grabación.
- Registre las señales de EEG/EMG bajo la línea de base (es decir, el comportamiento de sueño/vigilia de un ratón que se comporta libremente). Eutanasia del ratón con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (200 mg/kg) después del último día experimental.