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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Diseccionar y preparar la larva de Drosophila CNS
NOTA: Los métodos para la disección del SNC de las larvas están claramente ilustrados en Hafer y Schedl, pero estos métodos publicados anteriormente reducen la longitud de las neuronas descendentes que son importantes para medir la frecuencia de los picos. Aquí, se describe un método adicional para extirpar el SNC larvario que mantiene largas e intactas las neuronas descendentes.
- Preparación salina.
- Prepare la solución salina de disección y registro de la siguiente manera en mM: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, ácido 4 2-[4-(2-hidroxietil)piperazina-1-il]etanosulfónico (HEPES); ajuste el pH a 7,25.
- Diseccionar las larvas de Drosophila CNS.
- Identifique y extraiga un tercer estadio errante de Drosophila melanogaster del vial de cultivo y colóquelo en 200 μL de solución salina (Figura 1A).
- Agarre los ganchos bucales con un par de pinzas finas y agarre el abdomen del gusano con un segundo par de pinzas (Figura 1B).
nota: No apliques demasiada presión en el abdomen, ya que esto puede provocar el desgarro de la fina capa cuticular del gusano.
- Tire suavemente de los ganchos de la boca y el abdomen en diferentes direcciones para separar el extremo caudal del gusano de la región de la cabeza y exponer las vísceras del gusano (Figura 1C).
nota: El SNC estará entrelazado con la tráquea y el tracto digestivo. No corte el SNC de ningún tejido para evitar cortar los nervios periféricos descendentes.
- Extraiga el SNC del tracto digestivo y la tráquea con fórceps (Figura 1D).
- Si es necesario, altere la barrera hematoencefálica seccionando manualmente el SNC posterior a los lóbulos cerebrales con tijeras de resorte Vannas.
nota: Esto debe hacerse en función de las propiedades fisicoquímicas del producto químico que se utiliza. La línea roja en la Figura 2A es el punto de transección sugerido y el SNC seccionado con troncos de nervios periféricos descendentes intactos que se muestran en la Figura 2B. El SNC seccionado está listo para la experimentación después de completar el paso 1.2.5.
>2. Registro extracelular del SNC de Drosophila.
- Prepare el SNC para la grabación.
- Extraiga un electrodo de pipeta de vidrio de los capilares de vidrio de borosilicato hasta una resistencia de 5-15 mΩ.
- Inserte el SNC seccionado en la cámara de cera que contiene 200 μL de solución salina. Sujete un alfiler de insectos sin recubrimiento con la pinza de cocodrilo soldada al cable de tierra e inserte el alfiler en la solución salina para completar el circuito.
- Con los micromanipuladores, oriente el electrodo hacia el extremo caudal del SNC seccionado. Elimine la grabación de ruido de fondo ajustando el nivel de umbral en el software de adquisición/análisis antes de entrar en contacto con los troncos de los nervios periféricos.
- Extraiga los nervios periféricos convenientes hacia el electrodo de succión aplicando una ligera presión negativa sobre la jeringa.
nota: La frecuencia de disparo basal se correlaciona con el número de neuronas atraídas hacia el electrodo, donde más neuronas a menudo resultan en una mayor resistencia del electrodo.
- Comienza el registro extracelular de la actividad nerviosa descendente del SNC.
- Inicie la grabación en el software de adquisición de datos y controle la frecuencia de disparo de referencia. Deje que la velocidad de disparo se equilibre durante 5 minutos antes de recopilar los datos de velocidad de disparo de referencia.
- Deseche la preparación y el registro si el patrón de cocción del tratamiento de control no es un patrón de estallido similar al que se muestra en la Figura 3A.
nota: El patrón alterado de disparo sugiere una actividad anormal o inestable del generador de patrones central, que puede alterar la función neuronal.
- Después de 5 min, agregue 200 μL de solución salina + vehículo para llevar el volumen total de la cámara a 400 μL para comenzar a registrar las tasas de disparo de control.
- Una vez establecido el valor basal (3-5 min), extraer 200 μL de solución salina y añadir 200 μL del agente experimental solubilizado en solución salina.
nota: El dimetilsulfóxido (DMSO) es el disolvente recomendado para los compuestos lipofílicos y no debe superar el 0,1% v/v.
- Aplique las concentraciones del fármaco de manera seriada (concentraciones bajas a altas) y registre cada concentración durante un período de tiempo seleccionado (determinado por el investigador en función de las propiedades químicas del medicamento). Etiquete este punto de tiempo de aplicación del medicamento en el software de adquisición/análisis incluyendo un comentario que incluya el medicamento y la concentración final.
nota: La actividad de disparo del SNC disminuirá en aproximadamente un 10-20% después de 30-50 minutos después de la disección y, por lo tanto, se deben realizar controles apropiados sin tratar y los tratamientos farmacológicos no deben exceder este período de tiempo.
